《Biosensors and Bioelectronics》：Ultrasensitive miRNA detection via magnetic bead-confined catalytic hairpin assembly enabling transcription-driven crRNA assembly and CRISPR/Cas12a activation
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CRISPR/Cas12a结合催化发夹组装（CHA）通过磁珠受限平台实现转录驱动crRNA重装与Cas12a激活，显著提升miRNA检测灵敏度至65.3 aM，并成功应用于肿瘤细胞系和血清样本检测，同时整合侧流层析法增强临床实用性。
潘明曦 | 吕梦梅 | 倪银刚 | 苏梅 | 赵成军 | 梅如宇 | 英展明
教育部环境友好化学与应用重点实验室；湖南师范大学化学学院绿色有机合成与应用重点实验室，湘潭，411105，中国
摘要
CRISPR/Cas12a与催化发夹组装（CHA）的结合是一种主要依靠CHA生成dsDNA激活剂以直接激活Cas12a的策略，已成为分子诊断中的强大工具。然而，仍存在两个主要挑战：dsDNA对严格原间隔序列（PAM）的依赖性以及发夹杂交产生的背景信号泄漏。在此，我们报道了一种基于磁珠的平台，该平台通过转录介导crRNA的重组和Cas12a的激活，从而实现超灵敏的miRNA检测。目标分子触发的CHA组装从三个最初锁定的发夹（H1、H2和H3）动态构建了一个T7转录模板，该模板不仅转录出支架RNA，还与其自身产物杂交形成DNA/RNA复合物，从而激活Cas12a。将分裂的T7启动子与CHA结合有效地抑制了背景信号，提高了检测灵敏度。此外，磁珠增加了局部浓度和反应动力学，共同显著提升了检测灵敏度。此外，专为转录驱动的Cas12a设计的crRNA组装策略不仅规避了传统的PAM依赖性dsDNA激活途径，还实现了无需额外激活剂的自我供应crRNA。我们证明了该生物传感器对miRNA-21的检测具有出色的灵敏度，达到了65.3 aM的检测限。此外，通过准确量化细胞系和人血清中的目标水平，初步验证了该方法的实用性。我们的方法提供了一种具有变革潜力的可行解决方案，旨在应对当代诊断应用中的复杂挑战。
引言
微小RNA（miRNA）是作为基因表达关键调节因子的小型非编码RNA（Gebert和MacRae，2019）。异常的miRNA表达水平与多种恶性肿瘤密切相关，使得miRNA成为疾病诊断的非常有前景的生物标志物（Winkle等人，2021）。然而，传统的miRNA检测方法，如微阵列（Schaudy等人，2022）、Northern印迹（Choi等人，2017）和定量逆转录实时聚合酶链反应（qRT-PCR）（Jet等人，2021），通常受到复杂仪器、训练有素的操作人员和繁琐操作程序的限制。最近，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）蛋白受到了广泛关注，并发展成为多个领域的开创性生物技术工具，包括转录调控（McCarty等人，2020；Qin等人，2025；Yang等人，2022）和分子诊断（Green等人，2022；Hu等人，2025）。特别是CRISPR/Cas12a系统由于其高效的转录切割活性而成为miRNA检测的主流平台，该活性在特定目标分子激活下无差别地降解周围的单链DNA（ssDNA）（Chen等人，2018；Xiao等人，2025；Zhao等人，2024）。然而，未经预扩增步骤的情况下，CRISPR/Cas12a系统对miRNA的检测灵敏度严重受限，仅达到皮摩尔（pM）水平（Huyke等人，2022；Ramachandran和Santiago，2021），这阻碍了基于Cas12a的生物传感器发展成为通用检测平台的发展。
为了解决这些限制，研究方向集中在通过工程化crRNA和引入等温扩增来提高CRISPR/Cas12a的性能。一方面，多项研究探索了通过各种方法修改crRNA以调节Cas12a的活性，包括延长crRNA长度（Liu等人，2025b）、光控技术（Li等人，2024）和分裂crRNA（Zeng等人，2025）。然而，这些策略的实际应用往往受到技术和经济挑战的阻碍。复杂的crRNA结构不仅成本高昂，还可能对Cas12a的转录切割活性产生不利影响。另一方面，当结合等温扩增时，Cas12a的灵敏度显著提高，等温扩增包括酶介导和非酶介导的方法。酶介导的等温扩增技术，如重组酶聚合酶扩增（RPA）（Liu等人，2025a）和环介导的等温扩增（LAMP）（Pan等人，2025），通过扩增特定目标序列显著提高检测灵敏度。最近，体外转录扩增作为一种强大策略出现，这得益于可编程转录开关的发展，允许在体外精确和动态地控制RNA输出（Gupta和Krieg，2024；Lee等人，2024；Xiong等人，2024；Yoon等人，2022）。Wang等人开发了一种基于CRISPR的方法，利用转录扩增自我供应crRNA以激活Cas12a，并实现了miRNA检测（Wang等人，2020）。然而，该系统未能将转录和Cas12a激活集成到一步中，这使得操作流程复杂化并延长了总检测时间。作为回应，非酶方法如CHA和HCR引起了广泛关注，作为稳健的替代方案（Jia等人，2022；Peng等人，2020），主要通过扩增激活剂与crRNA的结合来激活Cas12a。然而，非酶电路从根本上受到核酸探针随机扩散的限制，经常导致反应动力学缓慢和背景信号升高（Liu等人，2019；Xu等人，2022；Zhao等人，2025）。为了缓解这一问题，研究人员采用了复杂的空间限制和目标富集策略（Bao等人，2025；Ma等人，2025；Qing等人，2020）。例如，Sui等人使用的球形DNA纳米结构创建了一个高浓度的纳米级反应环境，显著提高了局部碰撞频率和反应效率，产生了用于Cas12a的特异性dsDNA激活剂（Sui等人，2025）。然而，这些先进配置通常需要外源性引入Cas12a激活剂，从而增加了系统的复杂性并可能影响实用性。因此，基于Cas12a策略的快速动力学和实验简便方法的发展仍然是一个重大挑战。
在此，我们构建了一种新型生物传感器，称为磁珠限制的CHA介导的模板激活CRISPR/Cas12a系统（MB-CHA@TA-CRISPR/Cas12a系统），用于miRNA的检测。目标miRNA触发CHA电路自组装成一个完整的T7转录模板，该模板被转录成支架RNA，与模板的粘性末端杂交形成功能性crRNA，最终激活Cas12a的转录切割活性。该设计将分裂的T7启动子与基于磁珠的CHA结合，有效抑制非特异性转录，最小化背景噪声，同时对低丰度miRNA实现高灵敏度。转录模板组装策略不仅介导支架RNA的转录，还作为Cas12a的激活剂，从而简化了实验程序。该策略成功应用于miRNA的检测，并用于准确分析不同肿瘤细胞系和人血清样本中的miRNA-21水平。此外，将这种方法与侧向流式检测（LFA）结合，展示了其在临床诊断中的潜在应用。
材料与试剂
所用材料和试剂的描述见支持信息。所有寡核苷酸序列列于表S1和S2中。
CHA介导的转录模板
首先，将单链发夹H1、H2和H3稀释并在95°C下热退火5分钟，然后逐渐冷却（1°C/分钟）以促进发夹形成。随后加入1 μL H1、H2、H3（每种10 μM）、不同浓度的1 μL miRNA-21、14 μL DEPC处理的水和2 μL NEB2.1缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM...）
MB-CHA@TA-CRISPR/Cas12a系统的工作原理
鉴于miRNA-21在多种癌症中异常过表达的临床相关性（Yan等人，2023），所提出的MB-CHA@TA-CRISPR/Cas12a检测方法利用CHA生成的转录模板来激活Cas12a进行检测。工作原理如图1所示。在这个设计中，整个反应过程可以分为两个功能模块。第一个模块在目标识别后触发CHA激活，组装一个完整的T7启动子转录...
结论
总结来说，我们建立了一种基于磁珠富集CHA的生物传感器，用于介导Cas12a的模板激活，从而实现miRNA的高灵敏度检测。这种级联扩增过程由CHA启动，随后通过转录进行，再通过磁珠浓缩反应组分，实现了检测灵敏度的协同增强。CHA介导的完整T7启动子的形成有效防止了非特异性转录...
CRediT作者贡献声明
潘明曦：数据整理、方法学、撰写——原始草稿。吕梦梅：资源获取、监督、验证。倪银刚：项目管理、软件。苏梅：正式分析、研究。赵成军：研究、验证。梅如宇：研究。英展明：概念化、资金获取、资源管理、监督、撰写——审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（21974041）、湘潭大学研究经费（21QDZ08）、湖南省自然科学基金（2023JJ30579）和湖南省卫生健康委员会科技项目（20255620）的支持。
