利用糖蜜培养的大肠杆菌（Escherichia coli）和伯克霍尔德菌属（Burkholderia sp.）实现聚-3-羟基丁酸（poly-3-hydroxybutyrate）的可持续合成：生产过程与特性分析

《International Journal of Biological Macromolecules》：Sustainable synthesis of poly-3-hydroxybutyrate by Escherichia coli and Burkholderia sp. cultivated with molasses: production and characterization

聚-3-羟基丁酸酯（P(3HB)）生物合成通过基因工程改造的大肠杆菌DH5α和天然菌株Burkholderia sp. MA13利用蔗糖蜜为碳源实现，DH5α菌株P(3HB)产量达47.3±6.7%，接近MA13的50.1±8.1%，薄膜热性能（初始降解温度294.9°C）和机械性能（拉伸强度26.3±2.1 MPa）优于文献报道。

　　

马塞乌斯·维克托·马索·拉科尔特·埃·席尔瓦（Matheus Victor Maso Lac?rte e Silva）|乔内克莱·阿尔维斯·巴雷托（Joneclei Alves Barreto）|佩德罗·恩里克·阿劳霍·莱亚尔（Pedro Henrique Araujo Leal）|英格丽德·吉村（Ingrid Yoshimura）|雷纳托·恩里克·卡洛雷（Renato Henrique Calore）|亚历山大·布鲁克（Alexandre Bruck）|马科斯·安德烈·莫拉·迪亚斯（Marcos André Moura Dias）|阿德里亚诺·乌埃穆拉·德·法里亚（Adriano Uemura de Faria）|法比奥·西蒙尼斯·德·维森特（Fábio Sim?es de Vicente）|罗多尔福·德博内·皮亚扎（Rodolfo Debone Piazza）|龙迪内利·多尼泽蒂·赫库拉诺（Rondinelli Donizetti Herculano）|米歇尔·布里恩佐（Michel Brienzo）|杰弗逊·格罗斯（Jefferson Gross）|乔纳斯·孔蒂埃罗（Jonas Contiero）

圣保罗州立大学（UNESP）生物科学研究所，地址：Av. 24-A 1515, 13506-900, Rio Claro, SP, 巴西

摘要

聚-3-羟基丁酸酯（P(3HB）是一种有前景的生物聚合物，可以替代石油来源的塑料，应用于包装等领域，并在生物医学和农业领域具有更高的附加值。优化P(3HB)生产的策略之一是使用能够代谢低成本底物并表现出快速生长的转基因菌株。在本研究中，大肠杆菌 DH5α cscBKAint.::pBR1MC-2::phaCAB菌株在使用糖蜜作为碳源时表现出了良好的性能，其P(3HB)产量占细胞干重的47.3±6.7%。这一表现与天然生产者Burkholderia sp. MA13菌株相当，后者的产量为50.1±8.1%。从这两种菌株获得的P(3HB)薄膜具有优于文献报道的热性能。DH5α菌株的初始降解温度为294.9°C，MA13菌株为291.4°C，熔点分别为181°C和175.99°C。在机械性能方面，DH5α菌株薄膜的最大拉伸强度为26.3±2.1 MPa，MA13菌株为23.5±2.4 MPa，断裂时的伸长率分别为8.75±1.4%和5.1±1.6%。这些结果证明了通过基因改造DH5α菌株利用糖蜜生产P(3HB)的有效性，并突显了两种菌株所生产薄膜在性能和潜在应用上的差异。

引言

由于石化塑料的多功能性、耐用性和低生产成本，它们被广泛应用于各个工业领域，成为现代社会不可或缺的一部分[1]。数据显示，全球塑料消费量急剧增加，估计1950年至2024年间总产量约为500万吨[2]、[3]。尽管这些材料在经济和功能上具有重要意义，但其使用却带来了严重的环境影响，以及由于降解缓慢、微塑料产生和生物累积潜力而带来的健康风险[4]。

微生物聚羟基烷酸酯（PHAs）是传统塑料的替代品，这类生物聚合物由多种微生物产生，其中细菌是最受研究的群体[5]。在PHA生产菌株中，Burkholderia因其高产PHA潜力而备受关注[6]、[7]。由于其可生物降解、生物相容性和可堆肥的特性，PHA在生物医学、制药、农业和食品相关领域的应用近年来得到了越来越多的探索[8]。

在PHA家族中，聚-3-羟基丁酸酯（P(3HB)因其内在的机械和物理化学性质而受到越来越多的关注，使其成为替代传统塑料的有希望的候选材料[9]、[10]。然而，P(3HB)的生产和回收成本仍然是大规模制造的主要限制因素，这使其相对于合成塑料处于劣势[11]。

为了在某些工业领域实现P(3HB)的大规模生产，需要进一步研究高产菌株的利用和/或降低生产成本的策略[12]。在这方面，将phaCAB基因引入具有生物技术潜力的菌株中的分子生物学技术越来越受到重视[13]。通过CRISPR–Cas9等成熟方法，可以引入参与PHA生物合成的基因（包括P(3HB)合成基因），以及能够利用替代碳源（如蔗糖）的基因[13]、[14]。由于大肠杆菌生长迅速且基因组特征明确，目前被广泛用作此类研究的模式生物[15]、[16]。

此外，寻找替代且低成本的PHA生产微生物培养基也变得越来越重要。由于碳源约占总生产成本的75%，因此优化策略也得到了广泛研究[17]。提出的替代品包括农业工业过程的副产品，如糖蜜（来自甘蔗和甜菜加工的副产品）[6]、[18]、[19]。除了经济因素外，PHA聚合物的性能还受到多种因素的影响，包括底物组成、复杂碳源的使用、聚合物分子量和所用微生物菌株[20]、[21]。尽管对可持续原料的兴趣日益增加，但关于利用糖蜜生产P(3HB)的研究仍然有限，特别是那些系统研究不同微生物菌株生产的P(3HB)的生物合成和薄膜特性的研究。

此外，以往使用phaCAB基因（参与PHA生物合成）在其他E. coli菌株中的研究通常依赖于诱导型启动子、多拷贝质粒或重复染色体插入来增加基因剂量并增强聚合物积累[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。相比之下，本研究中使用的大肠杆菌 DH5α菌株是通过PrJ23119–RBS–phaCAB–terminator配置组装phaCAB操纵子进行工程改造的[13]。这种简化的基因设计使得能够高效地利用糖蜜中的蔗糖生产P(3HB)，而无需额外的代谢重编程，只需引入用于利用蔗糖的< />操纵子。值得注意的是，这种策略无需化学诱导剂或抗生素选择压力即可实现生物塑料的生产，凸显了其作为稳定且具有工业应用价值的平台的潜力。

因此，本研究旨在评估使用糖蜜作为碳源的Burkholderia sp. MA13菌株和新型基因工程大肠杆菌 DH5α菌株生产P(3HB)的情况，并对所得P(3HB)薄膜进行表征。

微生物与培养条件

本研究使用了两种细菌菌株：大肠杆菌 DH5α cscBKAint.::pBR1MC-2::phaCAB，该菌株经过基因改造，能够利用蔗糖并合成PHA，其中参与PHA生物合成的phaCAB基因和与蔗糖代谢相关的cscBKAint基因通过CRISPR–Cas9整合到了基因组中[13]。E. coli DH5α的基因组序列已存入NCBI数据库，BioProject访问号为PRJNA1200122。

统计分析

对于初步的因子设计，数据使用GraphPad Prism 8.4.3版本（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）通过双因素方差分析（ANOVA）进行分析，随后进行Tukey事后检验（p < 0.05）。所有实验均重复三次，结果以平均值±标准差的形式呈现。

评估DH5α在糖蜜培养基中的生长情况

使用微孔板读数仪（设备品牌）测量E. coli DH5α在含有蔗糖和糖蜜作为单独碳源的培养基中的生长情况（图1A）。两种底物下都观察到了细胞生长；然而，根据碳源的不同，细胞进入指数生长期的时间有所不同。当使用蔗糖时，潜伏期约为24小时。

结论

经过基因改造的E. coli菌株cscBKAint.::pBR1MC-2::phaCAB DH5α表现出高效的蔗糖吸收能力，同时也能吸收果糖和葡萄糖，其中葡萄糖显著加速了生物量的积累并最大化了生长速率（μmax）。这些结果表明糖蜜是一种低成本的碳源，能够促进快速生长，进一步凸显了其工业价值。值得注意的是，该菌株的μmax和P(3HB)产量与天然生产者MA13相当。

作者贡献声明

马塞乌斯·维克托·马索·拉科尔特·埃·席尔瓦（Matheus Victor Maso Lac?rte e Silva）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，软件应用，项目管理，方法论研究，资金获取，数据管理，概念构思。乔内克莱·阿尔维斯·巴雷托（Joneclei Alves Barreto）：方法论研究，数据分析。佩德罗·恩里克·阿劳霍·莱亚尔（Pedro Henrique Araujo Leal）：数据验证，研究实施，数据管理。英格丽德·吉村（Ingrid Yoshimura）：撰写 – 审稿与编辑，数据可视化，软件应用，数据分析。雷纳托·恩里克·卡洛雷（Renato Henrique Calore）：数据可视化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢CAPES（高等人员培训协调委员会）项目编号88887.801977/2023-00、Fapesp主题项目2017/50249-6以及IPBEN（生物能源研究所）的支持。作者还感谢Mateus Manabu Abe女士和Danieli Fernanda Canaver Marin博士。