《Journal of Biological Chemistry》：Brucella Omp25 activates the unfolded protein response to promote intracellular proliferation and inflammation
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布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病，其病原体布鲁氏菌在宿主细胞内质网内复制，但该过程如何操控宿主内质网应激与未折叠蛋白反应(UPR)的机制尚不清楚。本研究聚焦于布鲁氏菌外膜蛋白Omp25，揭示其通过与内质网伴侣蛋白BiP结合，激活PERK、IRE1α、ATF6介导的UPR信号通路，进而促进细菌胞内增殖并增强炎症反应。该发现阐明了Omp25调控宿主UPR以建立慢性感染的新机制，为开发针对布鲁氏菌病的治疗策略和减毒疫苗提供了潜在靶点。
布鲁氏菌，这个听起来有些陌生的名字，实则是一种危害巨大的病原体。它引起的布鲁氏菌病是全球范围内最常见的人畜共患病之一，不仅严重威胁畜牧业发展，造成牲畜流产和不孕，导致巨大经济损失，更可感染人类，引发波浪热、关节炎、脑膜炎等多种慢性消耗性疾病，严重影响公共卫生安全。布鲁氏菌之所以如此“成功”地制造持续感染，其秘诀在于它独特的“寄生策略”——它入侵宿主细胞后，并非“流浪”于细胞质中，而是巧妙地“安家”于一个名为内质网(ER)的细胞器内，在那里建立一个被称为复制性布鲁氏菌包含空泡(rBCV)的专属“复制工厂”。内质网是细胞的“蛋白质合成与质检中心”，负责合成、折叠和运输蛋白质。布鲁氏菌的“入驻”无疑会扰乱内质网的正常结构和功能，引发所谓的“内质网应激”。面对这种压力，细胞会启动一套名为“未折叠蛋白反应”(UPR)的自我调节程序，旨在恢复内质网的稳态。然而，越来越多的证据表明，包括布鲁氏菌在内的许多病原体，似乎能够“劫持”或“利用”宿主的UPR信号通路，为自己创造更有利的复制环境。那么，布鲁氏菌究竟是如何做到这一点的？其外膜上那些直接与宿主内质网环境接触的蛋白质，特别是重要的外膜蛋白(Omp)，是否在其中扮演了关键角色？这成为了研究人员亟待解答的科学问题。
本研究的通讯作者团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表论文，深入探究了上述谜题。他们发现，布鲁氏菌的一个关键外膜蛋白Omp25，竟然是操控宿主UPR、促进自身繁殖和引发炎症的“幕后推手”。
为了揭示Omp25的作用，研究人员综合运用了分子与细胞生物学、微生物学及动物模型等多种技术手段。在细胞水平，他们使用了基因过表达、报告基因活性检测、免疫共沉淀(Co-IP)、免疫印迹(Western blot)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)以及免疫荧光共定位等技术，系统分析了Omp25对UPR三条分支通路（PERK、IRE1α、ATF6）及下游炎症信号（如NF-κB）的激活作用，并明确了Omp25与内质网伴侣蛋白BiP的直接相互作用。在蛋白质相互作用方面，研究采用了GST pull-down和生物层干涉技术(BLI)验证结合的特异性与亲和力。在感染模型方面，研究人员构建了布鲁氏菌流产杆菌(B. abortus)的野生型、omp25基因敲除(Δomp25)及回补菌株，在巨噬细胞系(RAW264.7)中评估了细菌的胞内存活与增殖，并检测了感染后宿主细胞的UPR与炎症应答。此外，研究还建立了BALB/c小鼠全身感染模型和C57BL/6孕鼠感染模型，以评估Omp25在动物体内的致病性、组织细菌载量、UPR激活程度以及引起的组织病理损伤（特别是胎盘炎症）。所有的动物实验均在中国农业科学院兰州兽医研究所的生物安全三级(BSL-3)实验室中进行，并获得了相应的伦理批准。
B. abortus Omp25触发PERK、IRE1α和ATF6介导的UPR信号
研究人员首先进行筛选，发现过表达Omp25能显著上调UPR标志基因BiP等的mRNA水平。进一步的报告基因和免疫印迹实验证实，Omp25能以剂量和时间依赖的方式激活UPR的所有三条核心通路：它增加了磷酸化的PERK(p-PERK)、磷酸化的eIF2α(p-eIF2α)和CHOP蛋白（PERK通路），促进了IRE1α的自磷酸化(p-IRE1α)和XBP1 mRNA的剪接（IRE1α通路），并提升了ATF6蛋白的剪切活化形式ATF6(N)的水平（ATF6通路）。这些结果首次表明Omp25是一个强大的UPR激活因子。
Omp25通过IRE1α-NF-κB信号轴诱导炎症
由于活化的IRE1α可以连接NF-κB炎症信号通路，研究人员接下来探究了Omp25是否也影响炎症。结果发现，过表达Omp25能剂量依赖性地增强NF-κB报告基因的活性，并显著上调IL6、CXCL10等促炎细胞因子基因的表达，但对I型干扰素相关基因无影响。使用IRE1α激酶抑制剂KIRA6或RNase抑制剂4μ8C处理，能有效抑制Omp25诱导的NF-κB活化和炎症基因表达。这表明Omp25通过依赖IRE1α激酶和RNase活性的方式，激活了IRE1α-NF-κB信号轴，从而选择性促进炎症反应。
Omp25通过与BiP的底物结合域(SBD)结合来激活UPR
Omp25如何能同时激活三条UPR通路？研究人员将目光投向了UPR的总调控蛋白——内质网伴侣蛋白BiP。共聚焦显微镜显示Omp25定位于内质网并与内源性BiP共定位。免疫共沉淀、GST pull-down和BLI实验均证实Omp25能与BiP发生高亲和力的直接相互作用，其平衡解离常数(KD)为27.6 nM。进一步的domain mapping显示，Omp25特异性地与BiP的底物结合域(SBD)结合。通过AlphaFold分子对接预测并构建了Omp25的缺失突变体(Omp25Δ105-108)，该突变体与BiP的结合能力及其激活UPR靶基因的能力均显著减弱，证实了特异性结合的关键性。
Omp25破坏BiP与PERK、IRE1α和ATF6的相互作用
在正常状态下，BiP与PERK、IRE1α和ATF6的腔内结构域结合，使其保持非活性状态。研究表明，过表达Omp25能显著减少BiP与这三个UPR传感器之间的结合。体外实验进一步证实，加入重组Omp25蛋白能以剂量依赖的方式竞争性抑制BiP与PERK、IRE1α、ATF6腔内结构域的结合。这些发现说明，Omp25通过直接“占据”BiP的SBD，将BiP从UPR传感器上“撬开”，从而解除了对传感器的抑制，触发了全面的UPR信号。
omp25缺失减弱布鲁氏菌诱导的UPR和炎症反应
为了验证Omp25在感染过程中的功能，研究团队构建了布鲁氏菌流产杆菌强毒株S2308和疫苗株A19的omp25缺失突变体(Δomp25)。体外感染巨噬细胞实验显示，Δomp25菌株在感染后期（72小时）的胞内存活和增殖能力显著低于野生型菌株。同时，感染Δomp25菌株的细胞，其BiP、p-IRE1α等UPR标志蛋白的表达，以及Bip、Chop、Il6、Tnfa等UPR与炎症相关基因的诱导水平均明显降低。用UPR激活剂衣霉素(Tm)预处理细胞，可以部分挽救Δomp25菌株的胞内复制缺陷，而回补omp25基因也能部分恢复UPR激活和细菌负荷。这直接证明了Omp25通过激活UPR来支持布鲁氏菌的胞内持续增殖。
omp25缺失减少布鲁氏菌在体内诱导的UPR和炎症
在BALB/c小鼠感染模型中，与感染野生型菌株的小鼠相比，感染Δomp25菌株的小鼠脾脏肿大程度减轻，脾脏和肝脏中的细菌载量显著降低。组织病理学损伤也得到缓解。更重要的是，感染Δomp25菌株的小鼠，其脾脏和肝脏组织中UPR相关基因和促炎细胞因子基因的表达水平，以及BiP和p-IRE1α蛋白水平，均显著低于野生型感染组。这表明Omp25在动物体内同样通过促进UPR和炎症来增强布鲁氏菌的致病力。
Omp25通过增强UPR激活促进布鲁氏菌感染期间的严重胎盘炎症
布鲁氏菌在孕畜中引起严重胎盘炎症和流产的能力是其重要致病特征。在孕鼠感染模型中，感染Δomp25菌株的小鼠，其胎盘细菌载量显著低于野生型感染组。组织学检查发现，野生型感染导致胎盘连接区和迷路区出现严重的浆液渗出、坏死和结构破坏，而这些病理变化在Δomp25感染组中大大减轻。基因表达分析也显示，Δomp25感染胎盘中UPR和炎症基因的诱导水平更低。这说明Omp25通过增强胎盘组织的UPR激活和炎症反应，加剧了胎盘炎症，从而增加了流产风险。
综上所述，这项研究系统阐明了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25在操控宿主细胞应答、建立慢性感染中的新机制。其核心结论在于：Omp25并非一个被动的结构蛋白，而是一个主动的“信号操纵者”。它利用自身定位于内质网衍生空泡的区位优势，直接高亲和力地结合宿主内质网的关键守门员——伴侣蛋白BiP的底物结合域。这一结合竞争性地破坏了BiP对三个UPR传感器（PERK、IRE1α、ATF6）的抑制性结合，如同拔掉了UPR信号通路的“安全栓”，导致三条通路被全面激活。其中，IRE1α通路的激活进一步联动NF-κB信号，放大了炎症反应。这一系列由Omp25引发的宿主细胞重编程，最终营造出一个有利于布鲁氏菌长期存留和增殖的细胞内环境，在动物体内则表现为更强的组织定植能力、更严重的炎症病理损伤（尤其是在胎盘）。该研究的意义重大，它首次将布鲁氏菌的一个主要外膜结构蛋白与宿主UPR信号通路的精确调控直接联系起来，揭示了病原体利用“结构蛋白模拟内质网应激”的一种新颖机制。这不仅深化了我们对布鲁氏菌这种重要胞内寄生菌致病机理的理解，也为对抗布鲁氏菌病提供了新的思路：靶向Omp25-BiP相互作用界面，或利用Omp25介导的UPR激活机制，可能成为开发新型抗菌疗法或构建下一代减毒疫苗的突破口。
