《Microbial Biotechnology》：Adh1-Programmed SNF1 Phosphogradients Decrypt Morphogenesis in Candida albicans: Chemical Interrogation Unveils Hyphal Transition Thresholds
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本综述揭示了白色念珠菌(C. albicans)乙醇脱氢酶I(Adh1)在菌丝形态发生中的非经典调控功能。研究发现，Adh1通过加速SNF1激酶的去磷酸化，抑制菌丝转化。天然产物2-羟基蒽醌(HAQ)被鉴定为Adh1的直接靶向抑制剂，其通过破坏Adh1与去磷酸化调节因子Bmh1/Ssb1的相互作用，降低SNF1磷酸化水平，从而阻断菌丝生长和生物膜形成。该工作不仅确立了Adh1作为内源性SNF1通路抑制因子及外源性药物靶点的双重角色，也为开发靶向毒力调控代谢酶的新型抗真菌策略提供了先导化合物与理论依据。
引言
白色念珠菌(Candida albicans)是一种常见于人体消化道、泌尿系统等生态位点的致病真菌，通常在免疫系统减弱或黏膜受损时引发感染。其致病性与形态转换密切相关，能够在酵母、假菌丝和真菌丝形态间切换。其中，菌丝形态在组织穿透、免疫逃逸和加剧系统性感染中起关键作用。然而，直接干预三种形态间转换的药物靶点尚未明确，驱动形态转换的确切机制也未完全解析。本研究聚焦于乙醇脱氢酶I(Adh1)，该酶不仅参与糖酵解等基础代谢，此前也被发现与真菌毒力增强、耐药性形成和免疫逃逸过程密切相关。研究旨在阐明Adh1在白色念珠菌多态性转换中的具体功能和机制，并尝试从天然产物中筛选靶向Adh1、影响多态性的先导分子。
结果
1. Adh1抑制生物膜内的真菌丝形成
生物膜为白色念珠菌提供了稳定的保护性生态，是复发性念珠菌感染的主要原因。成熟的生物膜构建包括黏附、萌芽、成熟和分散四个阶段，其中菌丝形成是侵袭性感染的核心环节。通过同源重组策略构建ADH1敲除株和ADH1基因过表达株后发现，高水平的Adh1抑制了菌丝在Spider培养基表面的延伸或向培养基内部的扩展。相反，ADH1的缺失促使真菌分化为真菌丝并更深入地侵入琼脂。与此表型一致，白色念珠菌菌丝相关基因（包括ECE1、HWP1、BCR1和TEC1）的mRNA水平也随Adh1表达量的改变而变化。因此，白色念珠菌Adh1是真菌丝形成的有效抑制因子，赋予了菌株在生物膜诱导条件下充足的多态性灵活性。
2. 靶向Adh1的化合物筛选
基于野生型和ADH1敲除白色念珠菌成熟生物膜的定量分析，研究筛选了一个涵盖多种类型化合物的天然产物库。考虑到药物作用的靶点依赖性，当蛋白质靶点缺失时，化合物的药效预期会发生改变。因此，监测天然产物在ADH1缺失前后对生物膜抑制率的变化是鉴定Adh1功能调节剂的关键策略。对114种天然产物的初筛鉴定出15个优先抑制野生型而非ADH1-KO生物膜的候选物。其中，蒽醌类是最富集的类别。检测结果表明，蒽醌类化合物如1,4-萘醌、2-甲基蒽醌、芦荟大黄素和2-羟基蒽醌(HAQ)在ADH1缺失后显示出生物膜抑制作用的显著降低。其中，HAQ和1,4-萘醌表现出最优异的活性，在40 μg/mL浓度下分别将总生物膜生物量下调97.3%和71.8%。值得注意的是，高浓度的HAQ未对白色念珠菌生长表现出显著抑制，这与ADH1不参与菌株生长动力学调控的事实相符。最终，研究检测了HAQ发挥生物膜抑制作用的Adh1依赖性。与对照组相比，敲除ADH1削弱了HAQ对成熟生物膜形成的限制作用，此时HAQ无法阻止生物膜内菌丝发育为真菌丝。相反，过表达ADH1是HAQ抑制活性的有效贡献因素，表明Adh1是HAQ的药理学靶点。综上所述，HAQ通过Adh1抑制白色念珠菌生物膜内的菌丝发育。
3. Adh1是HAQ的直接靶点
本研究通过将白色念珠菌的全蛋白溶液流经固定了蒽醌化合物大黄素的环氧活化层析柱，捕获能与蒽醌类相互作用的蛋白，随后用HAQ溶液竞争性洗脱HAQ特异性结合蛋白。在质谱鉴定结果中，根据MaxQuant评分大于50作为合理性标准，丰度最高的三种蛋白是转录因子Tup1、烯醇化酶Eno1和乙醇脱氢酶Adh1。这些结果表明上述三种蛋白都可能与HAQ相互作用。由于质谱无法表征直接的化合物-蛋白质结合，研究随后进行了分子对接模拟和体外实验验证。分子对接预测结果显示，Tup1和Adh1能够以稳定的构象与HAQ结合，结合能分别为-8.5 Kcal/mol和-8.0 Kcal/mol。考虑到Adh1也是本研究的焦点和HAQ的功能靶点，Adh1被初步鉴定为HAQ抑制生物膜的细胞内靶点。
通过异源表达获得重组Adh1后，在体外验证了HAQ与Adh1的相互作用。在差示扫描荧光法中，HAQ的存在导致Adh1在温度梯度场中仅显示一个熔解温度，且Tm值随药物浓度增加而升高。同样，在色氨酸荧光光谱实验中，随着体系中HAQ浓度的升高，色氨酸发射荧光的波长逐渐红移。上述结果表明，与HAQ共孵育不仅增强了Adh1中色氨酸周围环境的极性，还提高了Adh1的热稳定性，二者之间存在直接相互作用。随后通过微量热泳动评估二者亲和力，拟合得到亲和力大小为111.86 μM。最后，基于核糖体A位点抑制剂茴香霉素阻断白色念珠菌内蛋白质翻译，发现在菌丝诱导环境下，细胞内Adh1水平会随时间推移而降低。相比之下，在相同条件下，真菌培养物与HAQ共孵育可防止通常在菌丝诱导环境中发生的Adh1降解，使蛋白质水平保持稳定。这一结果意味着进入白色念珠菌的HAQ会直接与Adh1相互作用并增强其稳定性。综上所述，白色念珠菌Adh1是HAQ的直接靶点。
4. F224、A254、Q257是HAQ与Adh1结合的关键残基
为深入分析化合物-蛋白质相互作用，通过分子对接模拟了HAQ与Adh1的直接结合构象。结果显示，Adh1中共有11个氨基酸可能与HAQ结合。其中，化合物通过羰基和羟基与G180、S179和Q257形成共价氢键，并通过增稠的三取代苯环分别与F224和A254形成π-π共轭和σ-π超共轭。接下来，选取前10个对接构象并统计11个相互作用氨基酸的出现频率，F224和A254出现频率最高，其次是S179、Q257、G180、S249。为验证上述位点，以F224和A254为分割点，构建了一系列ADH1异源表达载体，获得在潜在HAQ结合氨基酸位点发生突变的Adh1。在此基础上，使用微量热泳动检测了HAQ与Adh1突变体的相互作用。结果显示，F224A导致Adh1与HAQ的结合无法检测到。与野生型Adh1相比，A254T和Q257A导致Adh1对HAQ的亲和力显著下降，亲和常数分别为528.48和4990 μM。相比之下，其余突变形式仅表现出相对温和的影响。上述结果表明，Adh1的F224、A254和Q257对于HAQ与Adh1的结合至关重要。
5. Adh1是HAQ调控SNF1活性的关键中间体
为分析Adh1调控白色念珠菌形态转换的下游信号网络，本研究利用亲和纯化-质谱联用技术，系统比较了HAQ和DMSO处理条件下Adh1相互作用的蛋白质组差异。通过整合生物信息学分析和文献挖掘，发现Adh1特异性共富集了真菌碳代谢核心调节因子SNF1激酶以及调控SNF1去磷酸化的关键复合体组分，而HAQ显著降低了这些调节元件与Adh1相互作用的强度。这暗示Adh1可能通过与真菌生物膜形成相关的SNF1信号通路来阻断真菌丝发育，而HAQ则通过靶向破坏Adh1-SNF1复合物的稳定性来调节SNF1信号通路的激活。
为阐明Adh1对SNF1磷酸化的调节作用，通过过表达和敲除ADH1进行了系统的功能验证。结果显示，在生物膜诱导条件下，ADH1敲除菌株的SNF1磷酸化水平与野生型和过表达菌株相比显著升高，证实Adh1是SNF1活性的负调节因子。为阐明分子相互作用网络，本研究在酿酒酵母BJ5464-NpgA中构建了His-Adh1和Flag-Bmh1/Flag-Ssb1共表达系统，发现HAQ特异性地削弱了Adh1与SNF1去磷酸化调节元件（包括Bmh1和Ssb1）的结合强度。值得注意的是，HAQ以剂量依赖的方式显著降低了SNF1磷酸化水平，且这种效应在ADH1缺陷菌株中显著减弱，表明Adh1是药物作用不可或缺的靶分子。总之，HAQ通过竞争性抑制Adh1与SNF1磷酸酶调节复合物的结合，以Adh1依赖的方式阻断了SNF1信号通路的激活，从而精确调控真菌形态转换过程。
6. HAQ通过Adh1-SNF1信号通路抑制菌丝转换
Sak1是白色念珠菌中唯一的专一性SNF1激活激酶。为考察SNF1磷酸化对实验菌株CBS562菌丝形态发生的调节作用，研究敲除了SAK1。检测发现，SAK1敲除菌株维持了极低的磷酸化水平。在Spider固体培养基和RPMI-1640（含10% FBS）液体培养基中，SNF1磷酸化缺陷的机体无法形成用于渗透延伸和三维空间结构组织的菌丝。此时，生物膜仅由酵母型细胞简单串联堆叠而成。与表型一致，SAK1敲除后菌丝相关基因的表达也显著下降，表明当细胞内SNF1处于低水平磷酸化状态时，菌株无法进展为菌丝形态，从而稳定保持在酵母形态。在结晶紫染色定量结果中，虽然SAK1敲除未显著影响成熟生物膜的生物量，但HAQ的生物膜抑制效应随之降低。同时，HAQ无法对受阻的酵母或假菌丝形态进行大幅度的形态学调整，这表明HAQ可能借助SNF1信号通路来限制菌丝形成，从而发挥生物膜抑制作用。
接下来，为探究SNF1信号通路与HAQ或Adh1在表型调节中的关系，使用激活剂上调SNF1磷酸化水平，以进一步确认HAQ或Adh1依赖SNF1发挥生物学效应。结果显示，以剂量依赖方式促进SNF1磷酸化的Dorsomorphin，显著下调了白色念珠菌成熟生物膜的生物量，并在ADH1敲除菌株中表现出增强的效力。考虑到预实验中ADH1敲除会在生物膜诱导条件下刺激SNF1激活，推测SNF1磷酸化高水平的叠加可能会限制菌株在生物膜构建周期中的形态可塑性。这些发现表明，升高的SNF1磷酸化在诱导白色念珠菌菌丝过度延伸的同时，损害了其形成分支菌丝和进行形态转换的能力，而这些能力是生物膜组装所必需的。因此，尽管SNF1磷酸化促进了菌丝延伸，但它同时抑制了生物膜形成。此外，Dorsomorphin促进野生型和ADH1过表达白色念珠菌发育为真菌丝，且形态趋于一致。因此提示，与野生型菌株生物膜内的假菌丝相比，由ADH1敲除或激活剂刺激介导的高水平SNF1磷酸化将促进菌株向真菌丝发育。当SNF1磷酸化水平维持在恒定状态时，Adh1无法在此基础上对菌丝形态做出某些调整，这表明Adh1是通过调节SNF1磷酸化来发挥表型调节效应的。由于ADH1敲除菌株的生物膜生物量在高浓度Dorsomorphin中过低，表征其菌丝形态不可行。最后，在生物膜诱导条件下，用Dorsomorphin和HAQ共同处理菌株。结果显示，两种药物协同抑制生物膜形成。在这种情况下，共处理组的真菌表现出真菌丝形态。也就是说，当体系中存在Dorsomorphin时，HAQ无法发挥显著的菌丝形成抑制作用。上述结果表明，HAQ通过促进SNF1去磷酸化从而下调SNF1磷酸化水平，将白色念珠菌阻滞在酵母形态。总之，HAQ通过Adh1-SNF1信号通路缓解白色念珠菌的丝状化。
讨论与结论
表型可塑性是白色念珠菌最典型的致病特征，由不同形态细胞和胞外基质组成的生物膜是临床耐药性念珠菌病的主要挑战。本研究关注了与致病性相关的白色念珠菌多功能糖酵解酶Adh1。现有研究表明，该酶通过醇-醛代谢调节黏附、菌丝发育和生物膜形成等毒力过程，但其具体效应或机制尚无定论。因此，研究敲除或过表达了实验菌株CBS562的ADH1基因。与文献报道的ADH1敲除破坏临床标准菌株SC5314菌丝发育不同，CBS562反而因敲除形成了过度延伸的菌丝。观察发现，CBS562形成的生物膜内菌丝主要以假菌丝形式存在，周围散布大量酵母型细胞，表明CBS562具有更强的多态性。在此基础上，敲除ADH1介导假菌丝进一步延伸为过度伸长的真菌丝，而过表达ADH1则促进菌株向酵母状态转换。CBS562表现出的灵活性为理解Adh1在多态性调控中的功能提供了机会。
基于靶点的药物发现是新药开发的常见策略。本研究基于野生型和ADH1敲除菌株的生物膜模型，发现蒽醌类化合物通过Adh1发挥对白色念珠菌的生物膜抑制作用。尽管先前研究中关于活性蒽醌类的报道仅限于生物膜表型或特定基因表达，本研究尝试从化合物靶点角度探索其作用机制。在四种以Adh1为功能靶点的蒽醌类化合物中，只有HAQ能够在不影响白色念珠菌生长的情况下发挥最显著的生物膜抑制活性。考虑到ADH1的敲除或过表达也不影响菌株的生长动力学，HAQ被认为是调节Adh1、从而调整菌丝形态方向最合理的调节剂。随后，研究反向探索了HAQ的靶蛋白。将活性低得多的大黄素作为弱结合药物固定在环氧活化琼脂糖微球中，然后用HAQ竞争性洗脱蛋白。质谱鉴定结果显示靶蛋白Adh1获得高分。随后的差示扫描荧光法和微量热泳动等实验也证实了HAQ与Adh1的直接相互作用。
接下来，通过将亲和纯化与质谱检测耦联，检测了受HAQ影响的Adh1相互作用蛋白，以探索Adh1调控白色念珠菌生物膜菌丝形成的下游信号。在以往研究中，具有白色念珠菌生物膜或菌丝抑制功能的蒽醌类化合物常表现出调节糖酵解或三羧酸循环相关基因表达、抑制代谢等活性。类似地，删除ADH1在抑制生物膜的同时，也调节真菌内的线粒体代谢和ATP产生。因此，在质谱数据中重点关注了与能量代谢相关的SNF1及其多个去磷酸化调节因子。研究表明，SNF1参与酿酒酵母生物膜形成的调节。在过量葡萄糖刺激下，SNF1失活将介导DNA结合蛋白Mig1易位至细胞核，阻止替代能量利用基因的表达，并通过与Tup1、Ssn6等结合负调节细胞内絮凝相关蛋白Flo11的水平，最终拮抗生物膜形成。此外，菌丝生长的负调节因子Nrg1和Nrg2也可以作为SNF1激酶的直接或间接靶点，从而参与酿酒酵母的菌丝分化和侵袭性生长。这暗示SNF1是Adh1调节白色念珠菌生物膜形成的潜在效应分子。由于缺乏市售的特异性靶向白色念珠菌蛋白的抗体，研究通过在酿酒酵母中表达带His或Flag标签的蛋白，通过Co-IP复核质谱信息，在此强调了HAQ下调Adh1与Ssb1或Bmh1相互作用的现象。值得注意的是，现有线索不足以解释HAQ以及Adh1在调节SNF1磷酸化方面的机制。关于Adh1是否借助Ssb1和Bmh1调节SNF1活性，以及HAQ是否通过调节Adh1与Ssb1或Bmh1的相互作用来影响SNF1激活，需要通过干预Adh1与调节蛋白之间的相互作用来进一步证实。在SNF1磷酸化检测结果中，Adh1缓解了白色念珠菌SNF1的激活。当ADH1被敲除时，SNF1在生物膜诱导条件下维持高水平的磷酸化。此外，HAQ不仅下调了Adh1与SNF1去磷酸化调节因子之间的相互作用，而且还依赖Adh1发挥SNF1磷酸化抑制剂的功能。这一结果同样为Adh1参与SNF1磷酸化调节提供了更充分的证据。
在白色念珠菌SNF1磷酸化检测结果中观察到了两条免疫印迹条带。Lambda蛋白磷酸酶处理实验证明，观察到的两条条带都是SNF1特异的磷酸化形式。敲除SAK1使下方条带减弱至野生型的15%，因此用该条带来表征SNF1磷酸化。研究意外发现，常用的AMPK抑制剂Dorsomorphin以剂量依赖的方式促进了实验菌株中SNF1的磷酸化。考虑到Dorsomorphin促进野生型和ADH1过表达菌株发育为真菌丝，同时限制了HAQ和Adh1对菌丝形态的调节，而SAK1敲除菌株仅呈现酵母样状态，且由ADH1敲除引起的高水平SNF1磷酸化同样介导菌株形成真菌丝，因此得出结论：白色念珠菌生物膜内机体的形态直接受SNF1磷酸化程度控制，而HAQ和Adh1借助SNF1磷酸化来调节菌丝形成。Dorsomorphin促进白色念珠菌SNF1磷酸化的免疫印迹结果在此得到确认，与文献报道的差异归因于物种间代谢调节的差异。由于Dorsomorphin在SNF1磷酸化Western印迹实验中抑制上方条带磷酸化的同时促进下方条带磷酸化，推测Dorsomorphin可能优先抑制负责上方条带（其他位点）磷酸化的激酶。这种抑制可能导致磷酸基团或激酶对Thr208位点的可用性相对增加，在我们的检测中表现为对功能性（下方条带）磷酸化的明显整体促进。此外，实验结果证明，促进SNF1去磷酸化的HAQ抑制菌丝延伸，而增强SNF1磷酸化的Dorsomorphin则诱导菌丝过度延伸。这些结果与SNF1磷酸化促进菌丝延伸的假设一致。然而，HAQ和Dorsomorphin在生物膜形成上表现出协同抑制效应。这种现象可能归因于完整的菌丝多态性是生物膜正常发育所必需的。
