番茄（Solanum lycopersicum）叶片施用纳米铜微量营养素制剂的代谢物谱分析——一种分子对接与动力学模拟方法

《Results in Chemistry》：Metabolites profiling in tomato ( Solanum lycopersicum) plants on foliar application of nano-copper micronutrient formulation – A molecular docking and dynamics simulation approach

　　

本研究呈现了纳米铜微量营养素液体制剂的合成、物理化学表征和生物学评估，重点关注其对番茄叶片代谢和分子相互作用的影响。使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）对纳米铜制剂进行表征，其在3269 cm^?1、2179 cm^?1、2156 cm^?1、2014 cm^?1、1622 cm^?1、1401 cm^?1、1100 cm^?1和516 cm^?1处显示出明显峰。透射电子显微镜（TEM）成像确认了球形铜纳米颗粒，尺寸范围为45至55 nm；X射线光电子能谱（XPS）分析显示纳米铜在933.5 eV和953.0 eV处有两个峰，分别对应Cu2p_3/2和Cu2p_1/2。动态光散射（DLS）测量表明平均粒径为53.7 nm，多分散指数（PDI）为0.223；Zeta电位值为?17.4 mV，表明分散和表面电荷稳定。对来自对照组（T1–0.5% CuSO₄叶面施用）和纳米铜微量营养素施用组（T2–0.1%纳米铜微量营养素叶面施用，T3–0.2%纳米铜微量营养素叶面施用）的番茄叶片样品进行气相色谱-质谱联用（GC–MS）代谢物谱分析，分别在T1、T2和T3中鉴定出26、34和21种化合物，其中T2（0.1%纳米铜微量营养素叶面施用）下记录的代谢多样性最高。利用STITCH数据库构建了代谢物-蛋白质相互作用网络，并据此选择代谢物，如2-羟基-2-甲基丁二酸和2-甲基丁酸，分别与靶蛋白琥珀酰辅酶A连接酶（Succinyl-CoA ligase）和电子传递黄素蛋白α亚基（electron transfer flavoprotein alpha）进行分子对接。后续的分子动力学（MD）模拟证实了稳定的复合物，蛋白质的均方根偏差（RMSD）值约为5.0 ?，配体约为5–5.5 ?，均方根波动（RMSF）大多在1至3 ?之间，关键氨基酸与配体残基之间以氢键或水桥相互作用为主。

**论文解读文章**

**研究背景**
铜等微量营养素是植物生长发育所必需的，作为质体蓝素和超氧化物歧化酶等酶的关键辅因子，参与电子传递过程并维持氧化还原平衡和结构稳定性。然而，传统铜肥因淋溶和地表径流导致效率低下，造成养分有效性降低及潜在的土壤污染或毒性。纳米技术的应用提供了有效替代方案，铜基纳米肥料可实现可控养分释放、增强叶面吸收并在较低浓度下提高表面反应性，从而克服传统制剂的局限性。铜基纳米材料因其在养分输送、病原抑制和胁迫缓解方面的多功能潜力，在可持续农业中备受关注。研究表明，纳米铜制剂可增强植物生长、养分吸收、抗菌活性和胁迫耐受性，同时降低与大量铜投入相关的环境风险。然而，这些纳米铜系统的生物学性能很大程度上取决于其物理化学特性（如粒径、分散性、表面电荷和功能化）及其与植物代谢和分子通路的相互作用。在番茄中，微量营养素处理可显著影响叶片代谢，进而影响植物生长、胁迫耐受性和产量结果。代谢组学分析技术（如GC–MS）能揭示这些生化变化，反映植物在代谢物水平的响应。结合计算机模拟方法（包括分子对接和分子动力学模拟）有助于阐明诱导代谢物与特定植物蛋白之间的相互作用，提供分子尺度的机制理解。本研究通过整合纳米材料表征、代谢组学分析和计算建模，为探索纳米铜微量营养素叶面施用如何调节番茄生理和生产力提供了全面框架。

研究人员合成了纳米铜微量营养素液体制剂，并对其进行了物理化学表征和生物学评估，随后在番茄植株上进行叶面施用，通过GC–MS代谢物谱分析鉴定代谢变化，利用STITCH数据库构建代谢物-蛋白质相互作用网络，并对选定的代谢物-蛋白质复合物进行分子对接和分子动力学模拟。研究发现，最优处理（T2，0.1%纳米铜微量营养素叶面施用）诱导了34种代谢物，显示出最高的代谢多样性；分子对接表明2-羟基-2-甲基丁二酸与琥珀酰辅酶A连接酶、2-甲基丁酸与电子传递黄素蛋白α亚基等具有结合亲和力；分子动力学模拟证实了这些复合物的稳定性。该研究证明纳米铜微量营养素通过调节番茄叶片生化代谢并形成稳定的分子相互作用，有望促进作物生长和产量，为纳米肥料的应用提供了分子层面的证据。论文发表在《Results in Chemistry》。

**主要关键技术方法**（不超过250字）
研究人员采用了以下关键技术方法：1）傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征纳米铜制剂的化学官能团；2）透射电子显微镜（TEM）观察纳米颗粒形态和尺寸；3）X射线光电子能谱（XPS）确认铜元素价态；4）动态光散射（DLS）和Zeta电位分析测量粒径、分散性和表面电荷稳定性；5）气相色谱-质谱联用（GC–MS）对番茄叶片代谢物进行谱分析，样品采集自印度泰米尔纳德邦农业大学（Tamil Nadu Agricultural University, Coimbatore）实验田，包括对照组（T1：0.5% CuSO₄叶面施用）和处理组（T2：0.1%纳米铜微量营养素叶面施用，T3：0.2%纳米铜微量营养素叶面施用），每个处理三次生物学重复；6）利用STITCH数据库构建代谢物-蛋白质相互作用网络；7）使用Schr?dinger Maestro软件进行分子对接（Glide SP和XP模式）；8）使用Desmond v3.2进行分子动力学模拟，采用OPLS-2005力场，分别在100 ns和50 ns下评估复合物稳定性。

**研究结果**

**3.1 纳米铜微量营养素的表征**
通过FTIR分析，纳米铜制剂在3269 cm^?1（OH伸缩）、2179 cm^?1和2156 cm^?1（C≡C伸缩）、2014 cm^?1（N=C=S伸缩）、1622 cm^?1（OH弯曲）、1401 cm^?1（CN伸缩）、1100 cm^?1和516 cm^?1（金属CuO伸缩）处显示特征峰。TEM成像证实球形纳米颗粒尺寸为45–55 nm。XPS显示933.5 eV和953.0 eV两个峰，对应Cu2p_3/2和Cu2p_1/2。DLS测定平均流体动力学直径为53.73 nm，PDI为0.223，Zeta电位为?17.4 mV，表明中等稳定性。制剂pH为3.13，黏度为9.75 cPs。

**3.2 代谢物提取–GC–MS分析**
GC–MS总离子色谱图显示不同处理（T1、T2、T3）在峰数量和强度上存在明显差异，表明代谢物组成发生变化。

**3.3 代谢物的分离与鉴定**
在T1（对照）中鉴定出26种代谢物，T2中鉴定出34种，T3中鉴定出21种。T2（0.1%纳米铜微量营养素叶面施用）展现出最高的代谢多样性。

**3.4 GC–MS代谢物化合物与STITCH蛋白质复合（由纳米铜微量营养素应用诱导）**
通过STITCH数据库构建了纳米铜诱导代谢物与番茄叶片靶蛋白的相互作用网络，确定了关键代谢物-蛋白质相互作用对。

**3.5 纳米铜微量营养素诱导的GC–MS代谢物化合物与番茄蛋白的分子对接**
分子对接分析显示，2-羟基-2-甲基丁二酸（S）与琥珀酰辅酶A连接酶的结合能为?5.114 kcal/mol；2-甲基丁酸与电子传递黄蛋白α亚基的结合能为?4.791 kcal/mol；1,2,3,4-丁四醇[S-(R*,R*)]与乙烯响应甲硫氨酸合酶的结合能为?4.791 kcal/mol；2,2′-(亚硝基亚氨基)二乙醇与醇脱氢酶2的结合能为?4.382 kcal/mol。

**3.6 分子动力学模拟**
**3.6.1 均方根偏差（RMSD）**：琥珀酰辅酶A连接酶与2-羟基-2-甲基丁二酸复合物的势能为?211,200 kcal/mol，蛋白质RMSD约5.0 ?，配体RMSD约5.0–5.5 ?，表明复合物稳定。电子传递黄素蛋白α亚基与2-甲基丁酸复合物的势能为?309,000 kcal/mol，蛋白质RMSD约4.6 ?，配体RMSD约4.0 ?，同样稳定。

**3.6.2 均方根波动（RMSF）**：琥珀酰辅酶A连接酶复合物的平均RMSF约1.2 ?，大多数残基波动在1–3 ?之间，表明蛋白质骨架稳定。电子传递黄素蛋白α亚基复合物的平均RMSF为1.0 ?，N末端区域波动最大（约7 ?），其余残基维持在1–3 ?，保持结构稳定性。

**3.6.3 蛋白质-配体接触**：琥珀酰辅酶A连接酶与2-羟基-2-甲基丁二酸的相互作用中，残基LEU_74、ALA_245和LYS_246形成最频繁且稳定的接触，主要通过氢键和水桥介导。电子传递黄素蛋白α亚基与2-甲基丁酸的相互作用中，残基CYS_604和CYS_301建立最强的氢键相互作用，SER_297和CYS_606通过水桥贡献，TRP_25和TYR_342表现出中等疏水相互作用。

**总结讨论**
讨论部分回顾了FTIR、TEM、XPS、DLS和Zeta电位表征结果与前人研究的吻合性，指出纳米铜制剂具有球形形貌、窄粒径分布、中等黏度和负Zeta电位，有利于胶体稳定性。GC–MS代谢组学分析揭示了纳米铜处理诱导的代谢物变化，与已有研究一致，反映了植物的解毒和防御机制。分子对接和分子动力学模拟结果与前人报道的RMSD/RMSF范围和相互作用模式相符，证实了代谢物-蛋白质复合物的结构稳定性和结合亲和力。总体而言，纳米铜微量营养素通过调节叶片代谢并与关键蛋白形成稳定分子相互作用，可能促进番茄的生长和产量。

**研究结论**
合成的纳米铜微量营养素制剂成功表征为稳定、纳米尺度的分散体：FTIR确认了不同官能团的存在，TEM揭示了45–55 nm的球形颗粒，XPS展示了特征能量峰，DLS测量了约53.7 nm的流体动力学尺寸和0.223的PDI，Zeta电位（?17.4 mV）表明中等胶体稳定性。在番茄叶片上施用纳米铜引起了明显的代谢变化，在最优处理（T2）中检测到34种代谢物，表明纳米铜调节了叶片生化过程。计算对接和分子动力学模拟表明，关键代谢物如2-羟基-2-甲基丁二酸和2-甲基丁酸与蛋白质（琥珀酰辅酶A连接酶、电子传递黄素蛋白α）形成稳定复合物，具有有利的RMSD/RMSF图谱和强氢键/水桥相互作用。这些分子相互作用可能构成了番茄中观察到的生理响应（包括可能的生长和产量）的基础。然而，纳米铜微量营养素在作物生产力中的广泛应用潜力尚需未来田间尺度的验证。