用腐殖酸纳米颗粒进行预处理可以降低水培小麦幼苗中铜的细胞遗传毒性

《Chemistry and Physics of Lipids》：Priming with humic acid nanoparticles reduces copper cytogenotoxicity in hydroponic culture of wheat seedlings

纳米腐殖酸预处理通过增加小麦根系细胞外陷阱系统（RET）的细胞数量及分泌的蛋白质和DNA含量，显著降低铜的细胞遗传毒性，表现为根尖分生区异常分裂细胞减少和铜积累量下降。

　　

Natalia Gennadievna Menzyanova | Cathrine Kessler (Ekaterina Igorevna Shishatskaya) | Natalia Viktorovna Oreshkova | Aleksei Sergeevich Dorokhin | Svetlana Alekseevna Pyatina

西伯利亚联邦大学，Svobodnyi大街79号，克拉斯诺亚尔斯克，660041，俄罗斯

摘要

随着土壤生态系统中重金属的人为污染日益严重，有必要培育出对金属具有抗性的植物品种，包括农作物。目前，“启动效应”（priming）被广泛用于这一目的。该技术基于诱导植物预先适应环境的能力，从而提高其对后续各种压力因素的耐受性。本研究探讨了启动剂诱导的根际细胞外捕获（RET）系统中的预先适应机制对水培小麦幼苗中铜的细胞遗传毒性的影响。实验使用了不同平均直径的腐殖酸纳米颗粒（nHA，分别为68纳米和6.5纳米，浓度为100毫克/升）作为启动剂。结果表明，nHA能够增加根际细胞（BC）的数量以及RET基质中的蛋白质和细胞外DNA（exDNA）的含量。此外，nHA处理显著降低了铜的细胞遗传毒性（浓度为31 × 10^?5 M）：根际细胞的数量和存活率更高，而根尖中的铜含量以及根尖分生组织中具有有丝分裂异常的细胞数量均低于未经过nHA处理的对照组。这些发现表明，RET系统中的预先适应机制在提高根系对土壤污染物的耐受性方面起着关键作用。

引言

工业化与城市化的加速、农业对含铜杀菌剂的依赖以及未经处理或部分处理的废水在灌溉系统中的使用，是全球土壤生态系统受到重金属污染的主要原因。据报道，全球有超过500万地区的土壤受到重金属污染。Nemerow综合污染指数分析显示，低污染农田仅占可耕地总面积的14.07%（Yang等人，2022年）。重金属污染的总经济影响估计每年超过100亿美元（He等人，2015年）。重金属的积累会降低土壤生态系统的生物多样性、作物产量，并增加人类患各种疾病的风险（Karimi等人，2021年；Poggere等人，2023年）。 在重金属中，铜被认为是对植物根系最具毒性的之一（Shabbir等人，2020年）。由于铜在矿物和有机组分中的特异性吸收，它倾向于沉积在表土层，并主要在植物根部积累（Rehman等人，2019年；Mir等人，2021年）。过量的铜暴露会引发根系的多种毒性反应，例如活性氧（ROS）的产生增加、细胞膜和蛋白质的氧化损伤、增殖信号传导和激素稳态的紊乱（Rather等人，2020年；Farid等人，2021年；Li等人，2022年；Trentin等人，2022年），以及根尖分生组织中具有有丝分裂异常的细胞数量增加（Macar O等人，2020年；Macar T. K.等人，2020年；Liman等人，2021年）。这些变化会导致根系和地上部分的生长发育异常，从而降低作物产量。因此，培育出对金属具有抗性的植物品种对于农业技术和土壤修复具有重要意义。 目前，化学启动效应被认为是实现金属抗性植物表型工程化（无需基因改造）的最有前景的方法之一。这一现象基于启动剂诱导的植物各种功能系统的表观遗传变化。这些变化（即预先适应）决定了植物对后续压力因素的耐受性（Tan等人，2022年；Harris等人，2023年；Zhang等人，2024年）。例如，5-氨基苯丙氨酸（5-aminolevulinic acid）的启动处理可以促进番茄植株形成对有毒浓度铜具有抗性的表型（Kaya等人，2023年）。 铜对根系的毒性取决于根际代谢组，即根际代谢产物的数量和性质（Rehman等人，2019年；Chen等人，2022年；Trentin等人，2022年；Xu等人，2023年）。铜与根际代谢产物的螯合复合物的形成可以减少根细胞对铜的吸收。因此，寻找能够通过改变根际代谢组来减少铜从根际转移到根部的过程及其细胞遗传毒性的启动剂具有重要意义。 根际代谢组在很大程度上依赖于根际细胞（BC）的数量。根际细胞是一类代谢活跃的细胞，它们起源于根冠的薄壁组织，并在分化过程中从根冠表面脱离（Hawes等人，2000年）。根际细胞的一个显著特征是具有高分泌活性，能够分泌多种蛋白质（酶、阿拉伯半乳聚糖蛋白、组蛋白）、DNA、果胶多糖、黄酮类化合物、多酚类化合物以及有机和无机酸（Hawes等人，2016年；Driouich等人，2019年；Ropitaux等人，2020年）。根际代谢产物构成了一个高效的RET系统（Vincent等人，2020年），能够捕获各种化学物质的生态毒素（如重金属、农药、多环芳烃、纳米颗粒）。因此，能够增加根际细胞数量及其分泌活性的化合物可能有助于培育出对金属具有抗性的根系表型。在水培小麦幼苗实验中，腐殖酸纳米颗粒被证明可以剂量依赖性地增加根际细胞的数量以及RET基质中的蛋白质和exDNA含量（Menzyanova等人，2023年）。基于此，本研究提出了以下假设：nHA启动诱导的根际细胞-RET系统变化可以降低铜对根系的细胞遗传毒性。

小麦幼苗水培实验方案

1) 在含有铜的培养基中培养，不进行nHA处理； 2) 先进行nHA处理，然后再在含有铜的培养基中培养； 3) 在不含铜和nHA的蒸馏水中培养（对照组）。

nHA的制备与表征

稳定的nHA水分散液由Biotech LLC（俄罗斯克拉斯诺亚尔斯克）提供。Biotech LLC按照Selyanina等人（2021年）描述的方法制备了nHA。具体步骤包括：使用0.1 N NaOH从泥炭中提取腐殖物质，持续24小时（无需加热），过滤后用盐酸（pH 2.0）沉淀，并通过离心分离。为了获得不同粒径的纳米分散液，对分离出的腐殖酸进行了电化学处理。

小麦幼苗根部的铜含量

在含有铜的培养基中培养24小时后，根部铜含量呈剂量依赖性增加。当培养基中的铜浓度分别为15.5 × 10^?5 M和31 × 10^?5 M时，根生物量中的铜含量分别是对照组的19倍和43倍（图1a）。

小麦幼苗根部的MDA和脯氨酸含量

铜在根生物量中的积累引发了氧化应激。在培养基中铜浓度为15.5 × 10^?5 M和31 × 10^?5 M时，MDA含量分别增加了2.5倍和3倍。

讨论

根尖的根际细胞来源于根冠的薄壁组织。在分化过程中，根际细胞从根冠表面脱离并在根际环境中继续发挥作用。它们在根系适应各种非生物因素（如水分不足和高浓度植物毒素）的过程中起着关键作用。根际细胞的代谢产物对根系抗性表型的形成具有重要贡献。

结论

在含有nHA的培养基中萌发的小麦幼苗表现出较低的铜细胞遗传毒性。与未进行nHA处理的对照组相比，根尖分生组织中具有有丝分裂异常的细胞数量减少，而存活的根际细胞数量增加。因此，可以在含有nHA的培养基中进行萌发，这有助于促进铜抗性根系表型的形成。

作者贡献声明

Natalia Gennadievna Menzyanova：撰写初稿、验证结果、确定研究方法、构建研究概念。 Cathrine Kessler (Ekaterina Igorevna Shishatskaya：验证结果、监督研究过程、项目管理。 Natalia Viktorovna Oreshkova：撰写文本、进行修订与编辑、协调研究资源、制定研究方法。 Aleksei Sergeevich Dorokhin：撰写文本、进行修订与编辑、协助数据可视化。 Svetlana Alekseevna Pyatina：撰写初稿、协助数据可视化、开展实验研究、进行数据分析。

作者同意参与及发表

所有作者均同意参与本研究并同意发表研究成果。

伦理批准

本研究未涉及伦理方面的特殊要求。

资金支持

本研究得到了俄罗斯联邦科学与高等教育部（项目编号：FWES-2026-0006）的资助。

利益冲突声明

作者们没有需要披露的财务或非财务利益关系。

致谢

作者感谢西伯利亚联邦大学的共享使用中心提供的支持，特别是N. V. Maznyak博士的帮助。