基于DFT的集成建模与多目标优化在蛋白酶生产提取发酵中的应用

《Chemical Engineering Science》：Integrated DFT-guided modeling and multi-objective optimization of extractive fermentation for protease production

　　斯里马蒂·乌马塞卡尔|纳加乔蒂·维里文蒂
印度泰米尔纳德邦蒂鲁奇拉帕利国家技术学院，邮编620015

摘要
随着对具有治疗作用的蛋白酶需求不断增加，高效的生物分离技术如萃取发酵变得尤为重要，这种技术能够将生产与回收过程整合在一起。为了解决萃取发酵中存在的固有变异性和高资源消耗问题，建模与优化成为提高产量和品质的有效手段。本研究基于密度泛函理论确定的深共晶溶剂，建立了用于从枯草芽孢杆菌中生产和提取蛋白酶的集成数学模型。该模型整合了发酵、相互作用和提取等多个工艺尺度，并运用修正卢德克-皮雷特方程、艾林-朗缪尔方程以及欧拉-欧拉两相模型等关联式来描述萃取发酵过程。通过遗传算法、粒子群优化算法、贝叶斯优化算法和鲸鱼优化算法四种元启发式优化算法，最小化实验数据与模型预测数据之间的偏差，从而确定萃取发酵过程的各项参数。模拟结果显示，上层相中的蛋白酶浓度为62.5474克/升，提取效率为82.7%。该模型的准确性通过实验数据得到验证，两者之间的偏差仅为7.21%，显示出其在实际应用中的可靠性。此外，还采用了非支配排序遗传算法II进行多目标优化，涉及温度、反应器尺寸、溶剂浓度以及其他特定工艺因素等十个决策变量，目标是最大化蛋白酶产量、最小化溶剂消耗并提升整体工艺效率。优化结果产生了多组帕累托最优解，这些解被分为三类，分别对应不同用户在产量、工艺时间和效率方面的需求。

引言
近几十年来，快速的现代化进程和全球化趋势导致了生活方式的改变，进而显著增加了心血管疾病的风险。心血管疾病是全球范围内导致死亡的主要原因，据预测，到2030年，每年因心血管疾病死亡的病例数将超过2330万例（McGrath等人，1985年）。链激酶、纳曲酶和尿激酶等纤维蛋白溶解药物常被用于治疗心血管疾病（Altaf等人，2021年）。尽管这些药物总体上被认为是安全的，但其高昂的价格仍然是一个重大问题。由于蛋白酶在预防心血管疾病方面的显著作用，对其治疗应用的需求不断上升，这促使人们深入研究连续生产技术以提高生产效率（Ecker等人，2015年）。萃取发酵作为一种更高效且可持续的替代方法，可用于传统发酵和提取方法来生产和分离纤维蛋白溶解蛋白酶。通过在发酵液中加入可选择性调节的溶剂和盐类，萃取发酵能够同时实现微生物代谢产物的生产和提取。当溶剂和盐达到一定浓度时，会形成两相系统，有助于产品的提取，从而提高整个工艺的效率（Alves等人，2022年；Soares等人，2015年）。代谢产物和其他污染物在两相间的分布由其热物理性质决定（Asenjo和Andrews，2011年）。由于深共晶溶剂具有稳定性、无毒性且成本较低，将其作为绿色分离介质应用于萃取发酵，已成为传统溶剂的可持续替代品（Duan等人，2016年；Xu等人，2015年）。深共晶溶剂通常是通过将两种或三种成分按特定比例混合而成的，这些成分分别为氢键供体和氢键受体（Jiang等人，2018年）。然而，使用深共晶溶剂进行萃取发酵的一个缺点是，目前对其背后的作用机制了解还不够充分（Cabezas，1996年）。此外，无论过程中出现何种干扰，连续工艺都需要在整个生产周期内持续生产高质量酶剂。由于发酵和提取过程中涉及的各因素存在固有的不确定性，要维持萃取发酵过程的稳定效率面临诸多挑战（Valente等人，2015年）。因此，了解各种参数对工艺动态的影响并对其进行优化，对于提高连续蛋白酶生产的稳定性和可靠性至关重要。通过实验方式预测和评估每个参数的影响既困难又昂贵且耗时。因此，开发预测模型来模拟不同条件下的工艺动态，有助于设计、优化和控制工艺，为解决这一难题提供更为有效的方案（Biegler和Grossmann，2004年；Klatt和Marquardt，2009年）。为研究萃取发酵系统的分配行为，人们采用了多种建模策略，如ePC-SAFT状态方程模型（Reschke等人，2014年）、Othmer-Tobias模型（Rodrigues等人，2010年）、Setschenow模型（Marcus，2013年）、Bancroft模型（Zafarani-Moattar和Sadeghi，2005年）、活度系数模型（Veloso等人，2018年）、基于NRTL方程的热力学模型以及其他经验模型。但由于深共晶溶剂由两种独立成分构成，其结构较为复杂，要准确描述其相平衡状态就需要大量数据。此外，考虑到工艺的动态特性，尤其是在工艺持续进行较长时间的情况下，这一点尤为重要。充分考虑这些动态特性有助于在实际操作条件下更准确地描述和控制系统。目前，关于萃取发酵的建模研究主要集中在连续稳态系统上（Mündges等人，2015年；Prinz等人，2014年）。Neha等人研究了以PEG 400和磷酸盐作为溶剂进行淀粉酶动态多级逆流两相提取的建模方法（Patel等人，2018年）。Kaio等人则报告了对分批发酵、补料分批发酵和萃取发酵等多种发酵模式的建模，这些模型用于生物乙醇和二氧化碳的连续提取与脱除，并结合了细胞回收工艺（Rodrigues等人，2018年）。Weber等人提出了基于计算流力学的隔室建模方法，该方法利用单相计算流体力学模拟得到的速度场，有效描述了搅拌式液液提取塔中的质量传递过程（Weber等人，2020年）。Teke等人报道了一种用于原位液液萃取发酵的连续半分离生物反应器的设计与分析方法，该反应器将发酵过程与内部沉降器和溶剂提取-回收装置相结合，流体动力学分析以及非生物乳酸模拟结果表明，该反应器具有稳定的混合效果和有效的连续产品去除能力（Teke和Pott，2021年）。Sikazwe等人利用Aspen Plus?软件对甘蔗生物精炼厂中通过萃取发酵直接将糖转化为丙烯酸的过程进行了建模，结果显示，与传统发酵相比，该方法的温室气体排放量大幅降低（Sikazwe等人，2025年）。Salas-Villalobos等人则对用于生产奇异果素的多级连续反应器工艺进行了建模，结果表明，与单级连续系统相比，该工艺能提高生产效率并降低生产成本（Salas-Villalobos等人，2025年）。Campos等人报道了对带有二氧化碳脱除功能的萃取型补料分批乙醇发酵过程的建模，该模型展示了该过程的物质和能量平衡情况，并指出其具有改善热量去除效果和减少用水量的潜力（Campos等人，2022年）。Wang等人则对添加表面活性剂的丙酮-丁醇-乙醇萃取发酵过程进行了建模，他们利用浮力和表面张力平衡原理来描述发酵液相与生物柴油提取相之间的质量传递过程。

萃取发酵是一种先进的工艺策略，它将微生物发酵与原位产品去除相结合，通常通过两相提取系统来实现，以此缓解产品抑制现象并提高产量。虽然以往的研究已经为理解萃取发酵的动态特性提供了宝贵见解，但大多数模型仅关注单一尺度下的两相提取阶段，且在评估相平衡时过度依赖传统溶剂的经验关联式。这些方法无法准确描述生物质、底物和溶剂之间的复杂相互作用，也很少考虑溶剂引起的应力效应或工艺的可扩展性，因此其预测精度和实际应用价值都有限。为了解决这些问题，本研究开发了混合动力学模型，将这些模型与实验观测结果及理论框架相结合，从而能够全面描述萃取发酵在发酵动力学、溶剂-溶质相互作用以及两相提取等多个尺度上的动态特性。此外，还采用了多目标优化方法，同时兼顾多个关键工艺目标，包括最大化蛋白酶产量和最小化溶剂消耗。这种集成建模与优化方法为基于深共晶溶剂的蛋白酶萃取发酵提供了一种稳健且可扩展的解决方案，据作者所知，此前尚未有相关研究报道。

本文的结构包括针对萃取发酵不同尺度的数学模型构建，随后是对模型的验证以及多目标优化分析。萃取发酵过程的建模被系统地分为三个阶段：发酵、相互作用和提取。发酵动力学模型考虑了深共晶溶剂和盐类对微生物生长、产物活性及产量的影响，其中微生物死亡常数和蛋白酶降解常数是通过中心复合旋转设计及回归分析确定的。在之前的研究中，我们利用密度泛函理论计算来筛选出适合用于蛋白酶提取的深共晶溶剂和盐类组合。根据溶剂-蛋白酶以及深共晶溶剂-盐类对之间的相互作用能计算结果，甜菜碱:乙二醇组合与碳酸钠被确定为最理想的溶剂-盐类组合。这些基于密度泛函理论得出的相互作用能参数为理解溶剂-溶质间的亲和力提供了分子层面的依据，也为本研究中构建的相互作用模型和提取模型提供了参数设定基础。相互作用动力学模型则研究了深共晶溶剂与蛋白酶之间的相互作用，详细描述了形成完整复合物所需的溶剂消耗量，相关的动力学速率常数是通过艾林方程计算得出的。最后，提取模型则着眼于产物和污染物在两相间的分配行为和扩散过程，同时考虑了工艺过程中的各种固有变量。此外，还采用非支配排序遗传算法对相互作用过程和提取过程进行了多目标优化。在相互作用阶段的优化目标是在最大化溶剂-产物复合物浓度和未结合溶剂浓度的同时，最小化未结合产物的浓度。而在提取阶段的优化目标则是在最大化上层相中蛋白酶浓度的同时，最小化提取时间。本研究的结果为利用深共晶溶剂通过萃取发酵进行蛋白酶的工业生产提供了一种有效方法，而多目标优化则为提高生物分子生产的效率和质量带来了巨大潜力，这类生物分子具有广泛的应用前景。

片段摘录
萃取分批发酵工艺
本研究开发了一种萃取发酵工艺，该工艺利用枯草芽孢杆菌和季深共晶溶剂，实现从农业工业废弃物中连续生产蛋白酶并进行原位回收。该工艺通过三个相互关联的阶段——分批发酵、溶剂-蛋白酶相互作用以及两相提取——将发酵过程与基于溶剂的分离过程相结合（见图1）。所使用的深共晶溶剂为甜菜碱:乙二醇组合，辅以碳酸钠作为成相盐。

萃取发酵-发酵、相互作用和提取的混合模型
通过将机制性发酵模型与在5至40小时发酵周期内每隔5小时采集的生物质浓度、底物浓度和蛋白酶浓度等实验数据相拟合，从而确定了枯草芽孢杆菌产生蛋白酶的动力学参数。参数估算被构建为一个非线性优化问题，其目标是最小化实验数据与模型预测数据之间的平方误差之和。

结论
本研究开发的用于利用枯草芽孢杆菌和深共晶溶剂进行治疗用蛋白酶萃取发酵的综合性数学模型，能够准确描述这一工艺过程。该模型通过整合多个工艺尺度，为了解生产和提取过程中的动态变化提供了有力支持，同时也解决了产出物中存在的固有不确定性问题。实验数据与模型预测结果之间的一致性非常好，误差百分比仅为7.209%，这充分证明了该模型的可靠性。

伦理审批
本研究未涉及任何人类或动物实验。

作者贡献说明
斯里马蒂·乌马塞卡尔：撰写原始稿件、开展研究、进行正式分析、构思研究思路。纳加乔蒂·维里文蒂：负责文章审阅与编辑、模型验证以及研究指导。

知情同意
不适用。

资金支持
斯里马蒂·乌马塞卡尔声明，她所从事的研究得到了印度教育部的支持，具体为总理研究学者计划——2023年第五轮资助项目（PMRF编号：3503684）。

利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。