《Frontiers in Oncology》：Invasive stratified mucin-producing carcinoma of the cervix: a report of 34 cases of immunohistochemical and clinicopathological findings
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本文首次系统性回顾了34例宫颈侵袭性复层黏液性癌（ISMC）的临床病理与免疫组化特征，并与HPV相关的普通型宫颈腺癌（HPV-A UEA）对比。研究发现，ISMC具有发病年龄更早、肿瘤体积更大、侵袭性更强的特点，其免疫表型（p16块状阳性、CK7阳性、Ki-67指数高等）和特殊染色（PAS阳性）有助于诊断。研究推荐了一套包含p16、CK7、CK5/6、P40、p63、Pax-8和PAS的诊断组合，为临床精准识别这种具有较差无进展生存期的肿瘤亚型提供了依据。
摘要
本研究是一项回顾性分析，旨在探索侵袭性复层黏液性癌（Invasive Stratified Mucin-producing Carcinoma, ISMC）的免疫组化特征和临床病理特点。研究纳入了来自山东省肿瘤医院研究所的34例ISMC患者，并将其分为纯ISMC和混合型ISMC（后者合并了其他病理类型的肿瘤细胞），同时也收集了70例HPV相关性宫颈腺癌（HPV-A ECA）和22例胃型腺癌（GAS）作为对照。通过对比分析发现，约47%的ISMC病例为纯型，其临床病理特征与混合型无明显差异。与HPV-A UEA相比，ISMC患者的发病年龄更早（42.4±9.4岁 vs 48.7±10.2岁），肿瘤直径更大（平均3.54 cm vs 2.30 cm），生物学行为更具侵袭性，表现为更深的间质浸润、更高的淋巴血管间隙浸润（LVSI）率（70.6% vs 35.7%）、更高的淋巴结转移（LNM）率（41.2% vs 14.3%）以及更晚期的FIGO分期。在免疫组化方面，所有ISMC病例均显示p16块状阳性、CK7阳性以及较高的Ki-67标记指数（平均71.8% ± 12%）。CK5/6、Pax-8、P40和P63在癌灶周边和间质交界处呈局灶阳性。过碘酸希夫（Periodic acid–Schiff, PAS）染色显示肿瘤细胞胞质内存在细胞内和细胞外黏液。该研究推荐将p16、CK7、CK5/6、P40、p63、Pax-8和PAS作为诊断ISMC的面板标记物。生存分析显示，ISMC的无进展生存期（PFS）比HPV-A UEA更差，但优于胃型腺癌。
引言
宫颈癌是全球女性第四大常见癌症，与人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）感染密切相关。宫颈癌主要分为鳞状细胞癌（Squamous Cell Carcinoma, SCC）和宫颈腺癌（Endocervical Adenocarcinoma, ECA）。近年来，ECA的发病率逐年上升。根据国际宫颈腺癌标准和分类（IECC）系统，ECA分为HPV相关性腺癌（HPV-A ECA）、HPV非依赖性腺癌（HPV-I ECA）等亚型。2016年，Lastra等人首次描述了侵袭性复层黏液性癌（ISMC），认为它是ECA的一种形态学变异，与其前体病变——复层黏液分泌性上皮内病变（Stratified Mucin-secreting Intraepithelial Lesion, SMILE）相似。ISMC在成分上具有高度变异性，可作为单一成分（纯型）存在，也可与鳞状细胞癌、腺癌或神经内分泌癌等其他类型混合（混合型）。既往研究表明，ISMC表现出更强的侵袭性，更易发生局部复发和远处转移，预后较差。然而，目前关于ISMC的研究样本量均较小。因此，本研究对34例ISMC患者进行分析，以期更好地了解其临床病理特征，为诊断和预后提供参考。
材料与方法
患者
本研究在山东省肿瘤医院和研究所（山东第一医科大学和山东省医学科学院）进行。研究收集了2021年3月至2024年5月期间诊断为ISMC的34例患者，同时收集了70例HPV相关腺癌和22例胃型腺癌（GAS）作为对照。所有ISMC患者均接受了宫颈癌根治性手术。病例由两位资深病理医师在双盲情况下诊断，存在分歧时由第三位有经验的病理医师协助。所有病例信息均从电子病历系统获取。根据国际妇产科联盟（Federation of International Gynecology and Obstetrics, FIGO）分期（第7版）进行临床病理分期。肿瘤被分类为纯型（ISMC部分占整个肿瘤的90%以上）或混合型（ISMC部分占整个肿瘤的10%至90%）。
免疫组化
所有手术切除标本均用10%中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋，制备3μm厚连续切片，进行苏木精-伊红（Hematoxylin–Eosin, HE）染色和免疫组化染色。免疫组化染色采用全自动免疫组化机（Roche, USA）和En Vision两步法进行。使用的抗体包括Pax-8、p16、CK7、CK5/6、p40、p63、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、p53和Ki-67。特殊染色为PAS染色。结果判读标准详见原文。
HPV基因分型
采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）鉴定HPV亚型。
统计分析
连续变量（如年龄、肿瘤大小）采用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验进行分析。分类变量采用卡方检验或Fisher精确检验进行分析。Kaplan-Meier曲线用于生存分析。p值<0.05被认为具有统计学显著性。
结果
ISMC的临床特征
共纳入34例ISMC患者，平均发病年龄约为42岁（范围：22-67岁）。其中16例（47%）为纯ISMC，18例（53%）为混合型ISMC。在混合型中，7例混合了普通型宫颈腺癌（UEA），6例混合了鳞状细胞癌（SCC），1例混合了神经内分泌癌，1例混合了黏液腺癌，1例同时混合了ISMC、UEA和SCC。肿瘤最大直径范围为1.1至6 cm，平均约3.5 cm。在HPV感染方面，26例（76.5%）患者检测到HPV 18感染。34例ISMC中，32例（94.1%）为Silva模式C。淋巴血管间隙浸润（LVSI）存在于24例患者（70.6%），淋巴结转移（LNM）发生于14例患者（41.2%）。29例患者（85.3%）的肿瘤浸润深度超过宫颈肌层深度的1/3。FIGO分期从IB1期到IVB期不等。详细的临床信息见文中表1和表2。
ISMC的免疫组化特征
所有肿瘤均显示p16块状阳性、CK7阳性和PAS染色阳性。肿瘤的Ki-67指数在20%至90%之间（71.8%±12%，n=26）。除少数病例显示边界阳性外，CK5/6、P63、P40或Pax-8通常为阴性。所有肿瘤的ER和PR均为阴性（见表3）。
与HPV-A UEA临床病理特征的比较
与HPV-A UEA患者相比，ISMC患者发病年龄更早（42.4±9.4岁 vs 48.7±10.2岁，p=0.003），平均肿瘤直径更大（3.541±1.487 cm vs 2.303±1.499 cm，p<0.001）。ISMC浸润宫颈肌层更深（p=0.006），LVSI（p<0.001）和LNM（p<0.001）发生率更高，FIGO分期更晚（p<0.001），Silva分期更差（p=0.002）。详细比较见文中表4。
纯型与混合型ISMC临床病理特征的比较
纯型ISMC在发病年龄、肿瘤大小、LVSI、LNM、FIGO分期或Silva模式方面与混合型ISMC相比均无显著差异（p>0.05）（见表4）。
ISMC患者的生存信息
随访时间为3至45个月。3例患者失访，其余患者中有7例在治疗后发生肿瘤转移。最常见的转移部位是淋巴结系统转移（6/7），包括盆腔、腹膜后、纵隔和锁骨上淋巴结；其中2例患者出现阴道残端复发。1例患者发生肺转移。生存分析显示，ISMC的预后比HPV-A UEA更差（p=0.0321），但优于胃型腺癌（p=0.0109）。
讨论
复层黏液分泌性上皮内病变（SMILE）被认为起源于宫颈转化区的储备细胞，这些细胞是一种多能干细胞，可分化为鳞状和柱状细胞，是宫颈癌和癌前病变发生的主要细胞。世界卫生组织（WHO）在2020年将SMILE分类为HPV相关的宫颈原位腺癌。本研究中约76%的患者HPV18阳性，这与ISMC的HPV相关性一致。SMILE在形态上与高级别鳞状上皮内病变（HSIL）和典型原位腺癌有重叠，但含有明显的细胞内黏液，且不形成腺腔结构。ISMC以浸润性、破坏性生长为特征，被认为是从SMILE发展而来。
自2016年定义以来，ISMC的形态学特征逐渐被明确。肿瘤细胞浸润宫颈间质，形成复杂的柱状上皮细胞巢，细胞核中度异型，可见核分裂象和凋亡小体。周边细胞呈栅栏状排列，不同数量的细胞内黏液呈复层分布，无明显的腺体形成。由于ISMC常与宫颈腺癌或鳞癌共存，且在低分化时难以识别，因此在2020年ISMC实体被认识之前，病例常被误诊为腺鳞癌。本研究的免疫组化结果显示，ISMC具有p16块状阳性、CK7阳性、PAS染色显示丰富黏液、Ki-67指数高、ER/PR阴性、p53多为野生型等特征。P40和p63多为阴性或仅局部阳性。Pax-8在黏液性癌如ISMC中不表达。细胞角蛋白5/6（CK5/6）主要在鳞状上皮表达，在纯ISMC中为阴性，但在混合鳞癌的ISMC中，鳞癌细胞局部可呈阳性。本文推荐使用包含p16、CK7、CK5/6、P40、p63、Pax-8和PAS染色的诊断面板来鉴别ISMC与腺鳞癌、黏液腺癌、腺样基底细胞癌、浆液性癌和子宫内膜癌。
近半数ISMC为混合型，最常见的混合类型是UEA、SCC和黏液腺癌。因其混合形态，有研究者认为它是腺鳞癌的一种变体。据先前研究，ISMC约占ECA的10%。
SMILE和ISMC被认为都起源于转化区的储备细胞。研究表明，ISMC可不同程度地表达与储备细胞相关的干性标志物（如SOX2）。在上皮-间质转化（Epithelial–Mesenchymal Transition, EMT）过程中，ISMC高表达Snail和Twist等EMT相关转录因子，这可能导致其更具侵袭性的生物学行为和更差的预后，包括更晚的FIGO分期、更高的LNM率和Silva C模式。
本研究发现，ISMC患者的平均发病年龄比HPV-A UEA患者早约3.5岁。虽然之前有研究提示纯型ISMC肿瘤比混合型更大、恶性程度更高，但本研究结果与Yao等人的研究一致，未发现纯型与混合型在临床病理特征上有显著差异，这可能需要更大样本量的研究来证实。
总体而言，ISMC表现出比HPV-A UEA更大的肿瘤直径、更早的发病年龄、更高的LVSI和LNM发生率。绝大多数ISMC病例表现为Silva C模式，凸显了其高侵袭性和不良预后。在结直肠中，ISMC被视为高级别癌，可进展为印戒细胞癌。ISMC比UEA和SCC表现出更具侵袭性的生物学行为和更差的预后，更易发生淋巴结和远处转移，特别是肺转移。
既往研究显示，ISMC存在STK11、MET、FANCA、PALB2、PIK3CA、ERBB2、TP53和PTEN等多个基因的可能致病性突变。STK11突变与较差的临床结局相关，并常见于侵袭性行为的胃型腺癌中。PIK3CA和STK11基因的失活突变可激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，因此mTOR抑制剂可能是携带此类突变的ISMC患者的重要治疗选择。Zammataro等人的研究表明，使用PIK3CA抑制剂可显著减少小鼠的宫颈癌病变，提示靶向治疗可能适用于PIK3CA突变的ISMC患者。
先前研究报告，62.5%至100%的ISMC患者存在PD-L1阳性（联合阳性分数CPS≥1）。这表明PD-L1过表达可能在ISMC的侵袭性行为中起作用，并与较差的预后相关。鉴于抗PD-1抑制剂帕博利珠单抗已被批准用于治疗FDA验证的PD-L1阳性（CPS≥1）的晚期宫颈癌患者，ISMC患者可能从PD-1/PD-L1免疫治疗中获益。Cho等人的研究发现，ISMC的预后比HPV-A UEA差，但优于HPV-I ECA（包括透明细胞腺癌和胃型腺癌），这与本研究结果一致。此外，Feng等人对8个ISMC样本进行了全外显子组测序基因组分析。所有样本均显示低肿瘤突变负荷（TMB）并被归类为微卫星稳定（MSS）。值得注意的是，MUC4突变被发现是纯型ISMC特有的，而DMD和DMKN突变则在混合型ISMC中占主导。
本研究为单中心研究，样本量较小，可能存在选择偏倚和信息偏倚。此外，研究覆盖的时间段较长，临床指南和技术已发生变化，可能引入了潜在的混杂变量。未来需要进行多中心、大规模的前瞻性研究来确认这些发现的可靠性和普遍性。
结论
混合型ISMC的患病率与纯型相似，但其侵袭性强于HPV-A UEA，导致预后更差。免疫组化分析显示P16块状阳性、CK7和PAS染色阳性，以及高Ki-67指数。此外，CK5/6、Pax-8、P40和P63在癌灶的周边和间质交界处呈局灶阳性。未来的大样本量研究和遗传学分析对于增进我们的理解并改善患者预后至关重要。
