研究发现新型HBD基因突变可导致β-地中海贫血携带者出现正常范围Hb A2

《Annals of Hematology》：A novel HBD gene mutation associated with normal-range hb A2 in β-thalassemia carriers

本研究针对β-地中海贫血携带者筛查中因Hb A2水平正常或处于临界值而可能导致漏诊的问题，在一个中国家庭中鉴定出一种新型的HBD基因突变（c.93-21G>A）。研究表明，该突变通过激活隐蔽剪接位点导致内含子保留，产生提前终止密码子（PTC），进而触发无义介导的mRNA降解（NMD），最终降低了Hb A2的合成。这一发现对改善β-地贫的临床诊断与遗传咨询具有重要意义。

　　

论文解读

在地中海、东南亚以及中国南方地区，β-地中海贫血是一种非常常见的单基因遗传病。在中国南方，其携带者频率高达3-4%。对于这种疾病，预防是关键，而预防的第一步就是准确识别携带者。目前，临床上筛查β-地贫携带者的一个金标准是检测血红蛋白A₂（Hb A₂）的水平。在健康人中，Hb A₂约占血红蛋白总量的2.5%-3.5%，而β-地贫携带者的Hb A₂水平通常会升高（>3.5%）。因此，当一个人的平均红细胞体积（MCV）和平均红细胞血红蛋白量（MCH）偏低，同时Hb A₂升高时，医生就会高度怀疑其为β-地贫携带者，并建议进行基因检测以确认。

然而，这个看似明确的诊断标准有时也会“失灵”。临床上，医生们会遇到一些具有典型β-地贫血液学表型（即MCV和MCH降低）的个体，但其Hb A₂水平却处于正常的临界范围（例如3.0%-3.5%）。这种情况让诊断变得模糊，极易导致携带者状态的漏诊或误判。是什么原因导致了这些“不典型”病例的出现呢？已知可能降低Hb A₂水平的因素包括缺铁、α-地中海贫血特征以及δ-珠蛋白基因（HBD）的突变。其中，HBD基因编码Hb A₂的δ链，其突变虽然本身通常不引起临床症状，但若与β-地贫突变同时存在，则可能“掩盖”Hb A₂升高的典型特征，形成所谓的“正常Hb A₂型β-地中海贫血”，给临床筛查带来挑战。

为了揭示这一现象背后的遗传学机制，并提高诊断的准确性，一项发表在《Annals of Hematology》上的研究，对一个来自中国深圳的家族进行了深入探究。该家族中的先证者（即索引病例）具有β-IVS-II-654/β^N的基因型，这是一种常见的β⁺-地中海贫血类型，通常伴有Hb A₂升高。然而，她的血红蛋白电泳结果显示Hb A₂仅为3.1%，处于正常范围。为了寻找原因，研究人员在排除了合并α-地贫和缺铁等因素后，将目光投向了HBD基因。

关键研究方法

本研究综合运用了多种技术手段：首先，通过毛细管电泳进行血红蛋白分析，获取Hb A₂的定量数据。其次，利用包括多重缺口聚合酶链式反应（Gap-PCR）和反向点杂交（RDB）在内的常规方法筛查了23种常见的地中海贫血变异。接着，对β-和δ-珠蛋白基因进行Sanger测序，以发现可能的罕见突变。在发现新型突变后，采用迷你基因剪接分析在体外验证该突变对mRNA剪接的影响。最后，设计特异性引物，对先证者外周血样本的cDNA进行PCR扩增和测序，在体内验证突变转录本的存在。

研究结果

1. 鉴定出一种新型HBD基因内含子突变

通过对先证者及其家族成员的HBD基因进行测序，研究人员发现了一个新的杂合性内含子突变，其编号为NM_000518.5:c.93-21G > A（见图1A）。该突变在公共数据库HbVar中未见报道，属于新发现的突变。

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2. 突变与β-地贫共遗传导致正常Hb A₂表型

家系分析显示，该HBD基因突变与β-地贫突变（β-IVS-II-654）呈顺式排列（即位于同一条染色体上），共同遗传给了先证者、先证者的父亲及新生儿女儿。携带这两种突变的个体，其Hb A₂水平均处于正常范围（2.9%-3.5%），但血液学上仍表现为与单纯β⁺-地贫携带者 indistinguishable 的小细胞低色素性贫血。这表明该HBD突变并不改变β-地贫携带者的贫血程度，仅特异性地影响了Hb A₂的水平。

3. 突变激活隐蔽剪接位点导致内含子保留

生物信息学工具（Splice AI）预测，该突变会创建一个新的剪接受体位点（Acceptor Gain，得分0.84）（见图1B）。为验证此预测，研究人员进行了迷你基因剪接实验。结果证实，该突变导致了HBD基因第1内含子中19个碱基的保留（c.92_93ins19），插入位置与预测完全吻合（见图1C）。体内验证实验利用特异性引物成功从先证者cDNA中扩增出含有这19个碱基插入的转录本片段，进一步证实了异常剪接事件在体内的发生（见图2）。

4. 异常剪接触发无义介导的mRNA降解（NMD）

这19个碱基的插入导致阅读框移码，并在下游产生了一个提前终止密码子（PTC）。在真核生物中，含有PTC的异常mRNA通常会通过一种叫做无义介导的mRNA降解的细胞监视机制被识别并降解。因此，可用于翻译的、编码正常δ-珠蛋白链的mRNA数量减少，最终导致Hb A₂的合成降低。这解释了为何携带该HBD突变的β-地贫个体，其Hb A₂水平未能如预期般升高。

结论与意义

本研究成功在一个中国家庭中鉴定出一种新型的HBD基因剪接突变（c.93-21G>A），并阐明了其导致β-地贫携带者出现正常水平Hb A₂的分子机制。该机制可概括为：突变激活隐蔽剪接位点 → 导致内含子保留和移码 → 产生提前终止密码子（PTC） → 触发无义介导的mRNA降解（NMD） → δ-珠蛋白链合成减少 → Hb A₂水平降低。

这项研究具有重要的临床意义。首先，它揭示了“正常Hb A₂型β-地中海贫血”的一种新遗传病因，提醒临床医生和检验人员在遇到血液学表型典型但Hb A₂处于临界或正常范围的个体时，应考虑是否存在HBD基因突变共遗传的可能性。其次，研究强调了在常规地贫基因检测panel中纳入HBD基因测序的必要性，特别是在高发地区，以避免因漏诊而影响遗传咨询和产前诊断的准确性。最后，该发现丰富了人类HBD基因的突变谱，增进了我们对珠蛋白基因表达调控复杂性的理解。总之，这项研究为改善β-地中海贫血的精准诊断和预防策略提供了关键的科学依据。