《Mycological Progress》：Yeasts from the Peruvian native cacao (Theobroma cacao L.) phyllosphere and their biocontrol potential against Moniliophthora roreri
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为探索可持续防治可可霜霉病（FPR）的绿色方案，研究人员从秘鲁亚马逊地区原生可可的叶际分离并鉴定了酵母菌群。研究表明，本地可可叶际酵母多样性极高，并发现Wickerhamomyces anomalus和Candida sorboxylosa等菌株在体外能有效抑制病原菌Moniliophthora roreri的生长与产孢，展现出显著的生防潜力，为开发新型生物防治剂提供了重要候选资源。
在全球巧克力经济的背后，可可树（Theobroma cacao L.）的健康正面临严峻威胁。在拉丁美洲，一种名为霜霉病（Frosty Pod Rot, FPR）的病害正疯狂肆虐，其罪魁祸首是担子菌门真菌Moniliophthora roreri。这种病原菌专一侵染可可果实，能在干燥的“木乃伊”果上大量产孢，造成毁灭性的损失，严重时可达100%。目前，针对此病尚无特效的控制方法，农民主要依赖铜基和硫酸盐类杀菌剂，但这些化学药剂不仅成本高昂，还可能引发环境和公共健康问题。尽管木霉菌（Trichoderma spp.）等生防真菌已被应用，但其田间防治效果不稳定，受环境因素和剂型影响大。因此，寻找更有效、更环保的可持续生防策略迫在眉睫。在这其中，生活在植物叶、果表面的附生酵母菌逐渐走进研究者的视野。它们不仅是植物微生态系统的重要成员，更因其能通过营养竞争、分泌抗菌物质、产生挥发性有机化合物（VOCs）或“杀手毒素”等多种机制抑制植物病原菌，而展现出巨大的生防潜力。秘鲁是全球优质有机可可的第二大生产国，其亚马逊上游地区更是可可的起源和驯化中心，拥有丰富的可可遗传资源。然而，在此之前，人们对秘鲁本地可可叶际附生酵母的多样性及其对M. roreri的生防潜力却知之甚少。为此，一项聚焦于秘鲁亚马逊地区原生可可的研究应运而生，旨在揭开这片神秘叶际的“酵母宝库”，并从中挖掘对抗霜霉病的“天然卫士”。该研究成果最终发表在国际期刊《Mycological Progress》上。
为了回答上述问题，研究团队在秘鲁亚马逊大区的Bagua、Utcubamba和Condorcanqui三个主要可可产区，从18个地块（每个地块约1公顷，分布于低、中、高海拔）采集了健康可可的叶片和果实样本。研究人员通过经典的稀释涂布和“弹孢”捕获法分离附生酵母，利用酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂（YEPD）和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基进行纯化培养。对获得的纯培养物，他们结合菌落和细胞的宏观、微观形态特征，以及核糖体RNA基因的ITS（Internal Transcribed Spacer）和LSU（Large Sub-Unit）D1/D2区域序列进行分子鉴定，构建系统发育树以确定物种身份。在生防潜力评估中，研究选取了20株基于文献报道具有潜在生防特性的酵母菌株，在PDA平板上与来自秘鲁三个不同地理区域（代表了该国主要的M. roreri遗传多样性）的病原菌菌株（K-399, ELA-001, MBG-01）进行体外对峙培养实验。通过测量对峙15天后病原菌的生长面积和产孢量，并利用Kruskal-Wallis非参数检验和Conover事后检验进行统计分析，评估了各酵母菌株的拮抗效能。
研究结果
分离酵母与鉴定
研究从可可果实和叶片表面共获得96株酵母分离物，成功进行了形态学和分子鉴定。这些酵母分属于子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的16个属，共计30个物种。其中，Hannaella和Candida是物种最丰富的属。研究还发现了Hannaella和Pseudozyma属下的潜在新物种。在丰度上，Meyerozyma guilliermondii是分离频率最高的物种，在三个省份的十个地块中均有发现，且主要从果实表面分离得到。
酵母的拮抗作用
针对M. roreri生长面积的拮抗实验表明，来自三个地区的M. roreri菌株在受到不同酵母对峙时，生长均受到显著抑制。其中，菌株KLG-104（鉴定为Candida sorboxylosa）和KLG-014（鉴定为Wickerhamomyces anomalus）效果最为突出，几乎完全抑制了所有三个M. roreri菌株的生长。此外，菌株KLG-112（Yamadazyma paraaseri）也对三株病原菌的生长表现出显著的抑制效果。相反，菌株KLG-068（Meira plantarum）的拮抗能力最弱。
M. roreri产孢
在对病原菌产孢量的抑制方面，KLG-104（C. sorboxylosa）和KLG-014（W. anomalus）再次展现了最强的能力，几乎完全抑制了所有M. roreri菌株的产孢。KLG-068（M. plantarum）的抑制效果则最不显著。其他一些菌株，如KLG-073（“Hannaella phyllophila”）、KLG-115（Pichia sporocuriosa）、KLG-109（Saturnispora diversa）等，对特定来源的M. roreri菌株的产孢也有显著抑制效果。
最优酵母的来源
值得注意的是，在本研究中拮抗效果最强的三株酵母——KLG-104（C. sorboxylosa）、KLG-014（W. anomalus）和KLG-112（Y. paraaseri）——均分离自可可果实样本。这表明，来源于果实表面的酵母在抑制同样侵染果实的病原菌M. roreri方面可能具有特殊的生态适应性或拮抗机制优势。
研究结论与讨论
本研究首次系统揭示了秘鲁亚马逊地区原生可可叶际附生酵母的高度多样性，共鉴定出30个物种，极大地丰富了对该生态系统微生物资源的认知。其中，Meyerozyma guilliermondii被证实是当地可可农生态系统中广泛分布的酵母物种。
更重要的是，通过系统的体外拮抗实验，本研究成功筛选出对可可霜霉病病原菌Moniliophthora roreri具有极高生防潜力的酵母菌株。Wickerhamomyces anomalus KLG-014和Candida sorboxylosa KLG-104脱颖而出，能几乎完全抑制来自不同地理来源的M. roreri菌株的生长和产孢，显示出作为高效生物防治剂（BCA）的巨大潜力。这一发现与先前其他研究中W. anomalus对多种植物病原菌（如Botrytis cinerea）的生防活性报道相一致，也拓展了C. sorboxylosa在降解真菌毒素（如黄曲霉毒素B1）之外的生防功能。
与在巴西可可叶际的相关研究相比，本研究发现的最优拮抗菌株有所不同，这暗示了地理位置和宿主基因型可能塑造了独特的具有生防功能的酵母群落。例如，本研究验证的Rhodotorula mucilaginosa对M. roreri的抑制效果，与之前在哥伦比亚针对灰霉病的研究结果相互印证。
这些高效拮抗酵母的作用机制可能是多方面的，包括产生“杀手毒素”（如W. anomalus产生的panomycocin具有β-葡聚糖酶活性）、分泌抗菌挥发性有机化合物（VOCs）（如某些酵母产生的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇酯类等）、分泌细胞壁降解酶（如几丁质酶、葡聚糖酶），或者通过竞争营养和空间位点来发挥作用。此外，一些酵母还能诱导植物系统抗性。后续研究需要深入解析W. anomalus KLG-014和C. sorboxylosa KLG-104的具体拮抗物质和作用模式。
综上所述，本研究的结论强调，秘鲁原生可可的叶际是一个尚未被充分开发的、富含酵母生物防治资源的宝库。所发现的W. anomalus和C. sorboxylosa菌株为开发针对可可霜霉病的创新、环保的生物防治方案提供了极具希望的候选菌种。未来的研究方向应集中于：鉴定这些酵母产生的特定拮抗化合物（如毒素、VOCs）；优化菌剂的制备、保存（如冷冻干燥技术）和田间施用剂型；开展田间防效试验以验证其实际应用价值；并进一步在未受扰动的亚马逊原始丛林中探寻可可及其野生近缘种上的天然抗病微生物资源，以期发现更多高效的生防因子，为保障全球可可产业的可持续发展提供坚实的科学基础。
