《Frontiers in Plant Science》：Genetic diversity and population differentiation of Parrotia subaequalis revealed by RAD-seq
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本研究运用简化基因组测序（RAD-seq）技术，对中国特有、极度濒危（CR）的孑遗树种小叶金缕梅（Parrotia subaequalis）的9个自然种群、233个个体进行了基因组层面的遗传学解析。研究通过高通量单核苷酸多态性（SNP）分析，首次揭示了该物种中等偏低但分布不均的遗传多样性水平（如平均核苷酸多样性Pi≈3.7×10-5），并明确了其地理遗传结构：桃岭（TL）种群独立成系，其余种群可大致分为大别山核心区和外围过渡群体两大集群。种群间遗传分化指数（Fst）范围在0.0168至0.1082之间，表明存在弱到中度的分化。此结果为制定基于遗传保护单元（conservation unit）的原位（in situ）与迁地（ex situ）保育策略提供了关键的基因组学证据。
引言
小叶金缕梅（Parrotia subaequalis）是金缕梅科中极具代表性的东亚第三纪孑遗树种，与伊朗的波斯铁木（Parrotia persica）为该属仅存的两个物种，具有重要的系统发育地位。因其绚丽的秋色、优美的树冠和可作药用的次生代谢产物（如鞣质、苯并呋喃类植保素）而具有观赏、科研及潜在药用价值。然而，在人类干扰加剧、栖息地退化与破碎化的背景下，其野生种群天然更新困难，种群规模显著下降，已被世界自然保护联盟（IUCN）列为极度濒危（CR）物种。野生小叶金缕梅主要间断分布于安徽、江苏、浙江的低中山区，其中大别山南坡是其核心分布区。遗传多样性与种群结构是评估濒危植物生存潜力和制定有效保护策略的重要科学基础。本研究运用简化基因组测序（RAD-seq）技术，对来自安徽及邻近地区9个自然种群的233个个体进行分析，旨在：（1）评估其自然种群的遗传多样性水平；（2）揭示种群间的遗传结构与地理分化；（3）探讨地理隔离与历史过程在种群分化中的作用，为理解和保护这一濒危物种提供遗传学依据。
材料与方法
研究共采集了9个种群233个个体的新鲜叶片样品，其地理位置、种群代码和规模详见图1和表1。采用改进的CTAB法提取基因组DNA。利用EcoRI单酶切策略构建了平均插入片段约350 bp的双末端RAD-seq文库，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行150 bp双端测序。原始数据经fastp质控过滤后，比对至本研究基于公开的牛津纳米孔长读长数据和Hi-C数据从头组装的染色体水平参考基因组。利用SAMtools mpileup和bcftools调用单核苷酸多态性（SNP），经过滤后得到136,252个高质量SNP用于后续分析。采用主成分分析（PCA）、群体遗传结构推断（ADMIXTURE）、基于邻接法（neighbor-joining, NJ）的系统发育树构建、成对群体分化指数（Fst）计算、核苷酸多样性（π）分析以及连锁不平衡（LD）衰减分析等多种方法，全面评估了种群的遗传结构、分化程度和多样性。
结果
3.1 种群遗传结构分析
PCA、ADMIXTURE和系统发育分析结果高度一致，共同支持小叶金缕梅存在一个清晰的三分遗传结构。PCA结果显示，桃岭（TL）种群在二维空间中独立成簇，与其他所有种群明显分离（图2a）。龙池山（LCS）和固井源（SDG）种群表现出遗传上的亲近性和部分重叠，而其余六个大别山区域种群（ND, MD, SDH, SDL, QLF, LWS）聚集为另一大群。在K=3的ADMIXTURE分析中，TL种群几乎由单一祖先成分构成，而LCS、SDG和QLF等种群则表现出不同程度的混合。
3.2 种群间遗传分化
成对Fst分析（图3a）表明种群间存在弱到中度的遗传分化（范围0.0168-0.1082）。其中，TL种群与其他所有种群的Fst值均较高（0.076-0.108），分化最显著，尤其与龙王山（LWS）种群的分化最强。大别山区域内部种群间的分化则较弱。邻接树（图3b）进一步支持了这一结果，TL种群形成一个独立且支持度高的分支，而大别山种群则紧密聚集在一起。
3.3 遗传多样性
遗传多样性分析显示，物种整体遗传多样性处于中等偏低水平。平均等位基因数（Na）为1.83，有效等位基因数（Ne）为1.24，多态信息含量（PIC）为0.146，核苷酸多样性（Pi）为0.000037，观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He）分别为0.092和0.170（表2）。不同种群间多样性分布不均，LWS种群具有最宽的π分布和最高的Pi值（0.0000558），而大别山核心区种群的π分布更集中，值相对较低。TL种群的多样性参数（Na, He, PIC）在所有种群中最低。连锁不平衡（LD）衰减分析（图4b）显示，LWS种群LD衰减最慢，暗示其有效种群规模（Ne）可能发生过变化或持续较小，加剧了遗传漂变。
3.4 地理分布与遗传结构的关系
遗传结构与地理分布高度相关。大别山区域种群（主要分布在长江以北）在遗传空间紧密聚集，分化弱。而位于物种分布区南缘（长江以南）的TL种群，与其他种群在PCA和系统发育树中均明显分离，显示出独特的遗传结构。长江水系和区域山地分布共同构成了基因流动的障碍，塑造了当前“强结构、中度但不均多样性”的地理遗传格局。
讨论
相比传统分子标记，RAD-seq生成的高密度SNP数据集显著提高了遗传结构推断的准确性。本研究结果与先前基于ISSR、SSR/cpSSR标记的研究结论一致，均证实小叶金缕梅种群间分化强、基因流受限。其“强结构、中度但高度不均多样性”的模式，是种群水平的生态过程（如空间聚集、小种群效应）、景观阻力（复杂山地地形、河流隔离）及历史气候事件共同作用的结果。TL种群表现出最低的多样性、最慢的LD衰减，可能源于长期隔离的孑遗谱系或近期因栖息地破碎化和人类干扰导致的严重种群收缩。这突显了其不可替代的进化独特性和高度的遗传风险。
基于以上发现，研究提出了分层级的保护框架。TL种群应作为高优先级保护目标，重点实施原位（in situ）保育和生境管理，以最小化干扰和隔离带来的遗传风险。多样性相对较高的大别山核心区种群（如SDH、MD、SDL、QLF）可被视为物种遗传变异的关键储存库，保育应优先维持其生境完整性和种群稳定性，并在可行时提升景观连通性。对于LWS这类保有独特变异的种群，需加强区域尺度的生境质量与连通性保护。对于ND、SDG、LCS等中等多样性种群，保护规划需综合考虑地形屏障和景观阻力对基因流的影响。此外，迁地（ex situ）保护应基于主要遗传集群进行代表性取样，以确保捕获谱系水平的多样性。
本研究揭示的“中度多样性、明确分化、多个独立遗传单元”的模式，是许多狭域分布孑遗树种的典型特征。这警示我们，基于物种水平平均指标的评估可能低估风险，需转向基于谱系或管理单元的保护决策框架。未来的研究可通过整合全基因组重测序、群体历史建模和基因组-环境关联分析，进一步阐明谱系分化机制，为小叶金缕梅及其他东亚孑遗濒危植物的科学保护提供更精细的指导。
