《Frontiers in Immunology》：Protective antigens hidden in the bovine Clostridium vaccine
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编者按：本研究聚焦于导致牛出血坏死性肠炎的主要病原体——A型产气荚膜梭菌。通过反向疫苗学技术，本研究筛选出高免疫原性的非毒素蛋白ESBP（胞外溶质结合蛋白）和YnjE（类硫氰酸酶结构域蛋白），与经典毒素蛋白Plc（磷脂酶C）一同进行了系统比较。研究发现，ESBP和YnjE在小鼠模型中可诱导高滴度IgG抗体和以Th2型为主的混合Th1/Th2免疫反应，其免疫保护效果（基于生存率与体重恢复）优于一种商品化多价疫苗（Vac3），与另一种（Vac2）相当。尤为重要的是，现有商品化疫苗对这两种关键非毒素保护性抗原的免疫潜力挖掘不足。本研究为非毒素蛋白作为新型疫苗核心候选抗原的开发提供了重要实验证据，并为疫苗抗原设计与优化开辟了新思路。
引言
A型产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性厌氧菌，是导致牛坏死性肠炎和皱胃炎的主要病原体，给大规模畜牧养殖造成重大经济损失。目前，广泛使用的多价梭菌灭活疫苗虽然安全且能提供广泛的覆盖保护，但其核心目标并非产气荚膜梭菌，针对该菌的实际防控效果缺乏明确数据支持。此外，随着养殖业“限抗”政策的全面实施，产气荚膜梭菌相关疾病的防控面临新挑战。
传统的细菌疫苗研发策略主要依赖于“以毒素蛋白为核心保护性抗原”，但在应对致病机制复杂的病原体时逐渐显现出局限性。随着基因组学、蛋白质组学等技术的进步，疫苗研发的重点正从传统毒素蛋白转向探索在病原体生命周期中起关键作用的非毒素蛋白。例如，利用反向疫苗学技术已成功开发出针对脑膜炎奈瑟菌B群血清型的亚单位疫苗Bexsero。
本研究的前期工作基于对15株牛源致病性产气荚膜梭菌的全基因组分析，利用反向疫苗学方法，从核心基因编码的蛋白质组中，筛选出两个高度保守、表面暴露且免疫评分优异的非毒素蛋白，即胞外溶质结合蛋白（ESBP）和类硫氰酸酶结构域蛋白（YnjE）。为比较非毒素蛋白与经典毒素蛋白的免疫学差异，本研究同时纳入了经典毒素蛋白磷脂酶C（Plc）。研究旨在通过抗体滴度检测、攻毒保护试验等多种方法，系统评估这两种非毒素蛋白与Plc的免疫原性和体内保护效力，阐明其作为疫苗候选抗原的潜力，为产气荚膜梭菌疫苗的研发提供新的见解和实验证据。
材料与方法
蛋白信息
通过反向疫苗学筛选，从NCBI和UniProt数据库中检索到三种蛋白的序列信息：α毒素/磷脂酶C（Plc）、胞外溶质结合蛋白（ESBP）和类硫氰酸酶结构域蛋白（YnjE）。此外，在前期实验中鉴定出一个免疫保护效力较弱的超氧化物歧化酶（SodF），其详细结果在补充材料中提供。
表达、纯化与免疫
将三种目标基因克隆到pET-32a表达载体中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。其中ESBP以可溶性形式表达，Plc和YnjE则以包涵体形式表达。通过镍柱亲和层析、透析和超滤浓缩获得纯化蛋白。使用纯化的重组蛋白，在不添加佐剂的条件下，通过腹腔注射免疫BALB/c小鼠和昆明小鼠，进行免疫和攻毒保护实验。
动物模型与实验设计
研究分为两个阶段。初步验证阶段使用遗传背景均一的近交系BALB/c小鼠，以评估重组蛋白的内在免疫原性和保护效力。扩展比较阶段采用远交系昆明小鼠，以比较重组蛋白与三种商品化多价梭菌灭活疫苗（Vac1, Vac2, Vac3）的保护效力差异。攻毒采用腹腔注射产气荚膜梭菌ATCC13124菌株的方式，监测小鼠7天内的生存率和体重变化。
检测指标
通过间接ELISA检测小鼠血清中针对Plc、ESBP和YnjE的特异性IgG抗体滴度。使用夹心ELISA试剂盒检测血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ等细胞因子水平。通过生存率和体重恢复情况评估免疫保护率。
结果
抗原表位分析
对Plc、ESBP和YnjE三种蛋白进行B细胞和T细胞线性表位及构象表位预测分析。所有预测的T细胞表位评分均高于90，其中YnjE的YRLASVLKY表位得分最高（95.7）。在B细胞表位中，Plc的SEGNDPSVGKNV表位得分最高。三种蛋白均含有多个高评分、表面暴露的表位，显示出良好的免疫原性潜力。
蛋白表达、纯化与抗体应答
三种重组蛋白均在大肠杆菌中成功表达并纯化，经SDS-PAGE和Western blot验证正确。间接ELISA结果显示，三种蛋白均能有效诱导小鼠产生高滴度的特异性IgG抗体。经过三次免疫后，Plc、ESBP和YnjE的最终抗体滴度分别达到1:819,200、1:1,638,400和1:1,638,400，其中非毒素蛋白ESBP和YnjE诱导的抗体滴度高于毒素蛋白Plc。
细胞免疫应答
免疫后小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平均显著升高。结果表明，免疫重组蛋白可诱导以Th2型为主的混合Th1/Th2型免疫应答，这与产气荚膜梭菌通过外毒素感染宿主并引发以Th2型为主的宿主免疫反应的特征高度一致。
免疫保护效力评估
在BALB/c小鼠攻毒模型中，Plc、ESBP和YnjE组的7天生存率分别为80%、90%和100%，免疫保护率分别为71.4%、85.7%和100%。在体重变化方面，YnjE和ESBP组的体重恢复速度快于Plc组和PBS对照组，显示出更好的保护效果。
在昆明小鼠模型中，与商品化疫苗比较发现，ESBP和YnjE蛋白提供的保护效力（生存率85%和90%）优于Vac3（75%），与Vac2相当，但低于保护效力最佳的Vac1（100%）。基于体重恢复的评价也得出了相似结论。
商品化疫苗的抗体应答分析
值得注意的是，尽管Plc、ESBP、YnjE和SodF四种蛋白都存在于所使用的商品化灭活疫苗中，但免疫这些疫苗的小鼠血清中，针对这四种蛋白的特异性抗体滴度普遍较低（最高仅为1:16,000），远低于单独使用相应重组蛋白免疫所诱导的抗体滴度。这提示现有疫苗可能未能充分激发针对ESBP和YnjE这两种关键非毒素蛋白的免疫潜力。
讨论
表位是蛋白质免疫原性的关键决定因素
本研究所涉及的Plc毒素蛋白以及ESBP和YnjE非毒素蛋白均为表面暴露蛋白。与定位于细菌内部的胞质蛋白相比，表面暴露蛋白具有更高的可及性，更易被B细胞受体直接识别，因此更有可能引发强烈的免疫反应。尽管表位预测的准确性存在争议，但通过预测并选择富含免疫优势表位的蛋白进行研究，仍是一种高效策略。
非毒素蛋白的免疫保护作用
本研究发现，ESBP和YnjE这两种看似参与代谢过程而非直接与毒力相关的非毒素蛋白，却显示出显著的免疫保护作用。其保护机制可能与“营养摄取-毒力增强”和“代谢枢纽-生存必需性”有关。例如，ESBP作为胞外溶质结合蛋白，可能参与锌、铁等必需营养元素的获取，而这些元素是Plc毒素活性所必需的。YnjE作为类硫氰酸酶超家族成员，可能在硫酸盐/硫代硫酸盐代谢等基础生存过程中扮演关键角色。抗体介导的中和作用可能通过干扰这些关键生理功能，从而严重破坏细菌活力，这可能是它们能作为保护性抗原的原因。
疫苗中的保护性抗原
本研究证实了ESBP和YnjE蛋白具有显著的免疫保护潜力。然而，在商品化疫苗（特别是Vac3）中，针对这两种蛋白的特异性抗体滴度较低，其免疫潜力未被充分挖掘。原因可能包括两方面：第一，全菌灭活疫苗含多种抗原，抗原间的竞争会分散机体免疫资源，削弱对ESBP和YnjE的特异性免疫应答；第二，疫苗的灭活及后续制备过程可能导致ESBP和YnjE蛋白构象改变或掩盖其关键抗原表位，从而降低其免疫原性。
一个有趣的观察是，尽管Vac1和Vac3包含相似的梭菌种类，但它们在产气荚膜梭菌的菌株类型和抗原比例上可能存在显著差异。这种差异提示，疫苗中关键的、起主导作用的保护性抗原很可能存在于这些有差异的成分中，值得深入探索。
结论
ESBP和YnjE蛋白的抗原表位显示出较高的免疫原性潜力。在小鼠攻毒试验中，这两种蛋白均表现出良好的免疫原性，并能有效抵抗产气荚膜梭菌感染。值得注意的是，在鼠模型中，ESBP和YnjE展现出的保护效力可与部分商品化疫苗相媲美，但其在牛体内的实际保护效果尚需进一步体内实验验证。虽然ESBP和YnjE具有强大的免疫原性和突出的保护活性，但在本研究所调查的部分商品化灭活疫苗中，其免疫潜力因抗原竞争和疫苗制备相关的结构变化而未得到充分发挥。综上所述，这些发现揭示了ESBP和YnjE作为核心候选抗原的应用潜力，并为深入研究其用于优化抗产气荚膜梭菌疫苗配方提供了依据。
