《Frontiers in Immunology》：The critical role of Atpif1 in Her2-targeted CAR-T cell therapy for solid tumor via modulation of metabolism and mtDNA-STING signal pathway
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本研究揭示了ATPIF1在HER2靶向CAR-T细胞治疗实体瘤中的关键调控作用。通过调节线粒体代谢重塑和线粒体DNA（mtDNA）泄漏激活的STING信号通路，ATPIF1的表达水平呈现出独特的双向调节效应：在体外，ATPIF1过表达可提升CAR-T细胞的杀伤活性和细胞因子分泌；在体内，ATPIF1敲低反而能增强其在低氧肿瘤微环境中的生存、浸润和抗肿瘤效果，这为优化CAR-T治疗实体瘤策略提供了新的代谢干预靶点。
引言
嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中已显示出显著的临床疗效，但将其应用于实体肿瘤治疗仍面临巨大挑战。这主要归因于肿瘤微环境（TME）的复杂性，包括抗原异质性、T细胞浸润不足、衰竭以及持久性差等因素。作为细胞能量代谢的中心，线粒体在决定T细胞分化表型和功能中起着核心作用，调控线粒体代谢可塑性被认为是增强CAR-T细胞抗肿瘤活性的有效策略之一。
ATP合酶抑制因子1（ATPIF1，也称为ATP5IF1）是一种进化上高度保守的线粒体蛋白，它通过结合ATP合酶的F1结构域，选择性抑制ATP的合成或水解，从而在调控细胞能量代谢中扮演关键角色。本研究旨在探究ATPIF1在调控靶向HER2抗原的CAR-T细胞抗实体瘤疗效中的作用及其潜在机制。
材料与方法
研究者构建了HER2靶向的CAR-T细胞，并通过基因工程手段分别上调（Her2-IF1 CAR-T）和敲低（Her2-shIF1 CAR-T）其ATPIF1的表达。通过蛋白印记、流式细胞术等方法验证了CAR和ATPIF1的表达。利用SKBR3-Luc+人乳腺癌细胞系评估CAR-T细胞的体外细胞毒性、白细胞介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）的分泌水平。通过Seahorse能量代谢分析仪检测细胞的耗氧率（OCR）以评估氧化磷酸化水平。在体内，将CAR-T细胞过继回输给荷瘤NCG小鼠，通过测量肿瘤体积、重量以及免疫组化染色分析其抗肿瘤效果、细胞浸润情况。利用Western Blot、实时荧光定量PCR等技术检测线粒体膜电位（MMP）、线粒体通透性转换孔（mPTP）开放、线粒体DNA（mtDNA）泄漏及STING信号通路相关蛋白的表达。
结果
ATPIF1过表达在体外增强HER2 CAR-T细胞功能，但在体内效果相反
体外实验表明，与亲本Her2 CAR-T细胞相比，ATPIF1过表达的Her2-IF1 CAR-T细胞具有更强的肿瘤细胞裂解能力，并分泌更高水平的IL-2和IFN-γ。Seahorse分析证实，Her2-IF1 CAR-T细胞的耗氧率显著升高，表明其线粒体呼吸功能增强。令人意外的是，体内实验结果与此相反。在过表达ATPIF1的CAR-T细胞中，尽管其在小鼠外周血和脾脏中的持久性（通过GFP+细胞百分比评估）显著优于亲本细胞，但其在抑制SKBR3移植瘤生长方面效果最差，肿瘤重量反而更大。在低氧条件（1% O2）下，Her2-IF1 CAR-T细胞的耗竭标志物（PD-1， LAG-3， TIM-3）表达显著升高。
ATPIF1敲低在体外削弱HER2 CAR-T细胞功能，但在体内增强其抗肿瘤疗效
与过表达的结果相对，ATPIF1敲低的Her2-shIF1 CAR-T细胞在体外表现出最慢的增殖速率、最低的肿瘤裂解活性和细胞因子分泌水平，其基础呼吸和最大呼吸能力也显著降低。然而，在荷瘤小鼠模型中，Her2-shIF1 CAR-T细胞却展现出最强的肿瘤抑制效果，其肿瘤重量在所有治疗组中最低，尽管在体外的功能表现最弱。这表明ATPIF1的表达对CAR-T细胞功能具有依赖于微环境的双向调节作用。
ATPIF1通过影响线粒体功能和细胞生存适应低氧环境
机制探索发现，ATPIF1过表达会增加线粒体质量，但降低线粒体膜电位。在常氧条件下，ATPIF1敲低会增加细胞凋亡率；但在模拟肿瘤微环境的低氧条件下，ATPIF1敲低反而能显著增强CAR-T细胞的生存率。免疫荧光分析显示，Her2-shIF1 CAR-T细胞在实体瘤组织中的浸润数量（CD3+细胞数/高倍视野）最多。临床乳腺癌组织的多色免疫组化分析也证实，组织中ATPIF1的表达水平与CD3+T细胞的浸润呈负相关，而与缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达呈正相关。
ATPIF1敲低通过mPTP开放和mtDNA泄漏激活STING通路
进一步研究发现，ATPIF1敲低会增加线粒体通透性转换孔的开放，并导致mtDNA（通过ND-1和D-loop水平评估）泄漏到细胞质中。泄漏的mtDNA随后激活了干扰素基因刺激因子（STING）信号通路，表现为磷酸化STING（p-STING）、VDAC蛋白表达上调，以及下游效应分子IFI44和IFN-β的mRNA水平升高。当使用乙锭溴（EB）耗竭CAR-T细胞的mtDNA后，不同CAR-T细胞间p-STING和VDAC的蛋白表达差异消失，证实了mtDNA泄漏是激活STING通路的上游事件。
STING通路的激活是增强CAR-T细胞迁移和体内疗效的关键
体外Transwell迁移实验表明，在低氧条件下，Her2-shIF1 CAR-T细胞的迁移能力最强，而使用STING特异性抑制剂H151处理后，这种增强的迁移被显著抑制。体内实验进一步证实，H151处理可逆转Her2-shIF1 CAR-T细胞在荷瘤小鼠中表现出的优越抗肿瘤疗效，强调了STING信号通路在该调节过程中的核心作用。
讨论
本研究系统阐明了ATPIF1在调控HER2靶向CAR-T细胞抗实体瘤功能中的关键作用及其矛盾性。在氧气充足的体外环境中，ATPIF1过表达通过增加线粒体质量和氧化磷酸化能力，增强了CAR-T细胞的效应功能和持久性。然而，在实体瘤常见的低氧、营养匮乏的微环境中，ATPIF1的过度表达可能会因过度抑制ATP合酶而加剧线粒体功能障碍、细胞凋亡和耗竭，反而损害疗效。
相反，适度的ATPIF1敲低在低氧环境下解除了对ATP合酶的抑制，使其能通过水解ATP来维持线粒体膜电位，从而提升了CAR-T细胞在恶劣肿瘤微环境中的生存能力。更重要的是，敲低ATPIF1诱发的mPTP开放和mtDNA泄漏，激活了STING依赖的先天性免疫通路，进而显著增强了CAR-T细胞向肿瘤组织的迁移和浸润能力，最终转化为更强的体内抗肿瘤效果。
该研究揭示了一个重要的转化医学困境：在标准体外条件下（常氧、高营养）旨在增强CAR-T细胞代谢和功能的工程化策略，未必能在复杂的体内肿瘤微环境中产生预期的治疗效果，有时甚至适得其反。ATPIF1及其下游的mtDNA-STING轴，为优化CAR-T细胞治疗实体瘤提供了新的代谢和免疫调节靶点。未来的CAR-T细胞设计需要更精细地考虑肿瘤微环境的影响，并开发能够动态响应微环境变化（如缺氧）的智能调控策略，以弥合体外性能与体内疗效之间的差距。
