《MicrobiologyOpen》：Synergistic Inhibitory Effect and Mechanism of Action of Cinnamaldehyde-Carvacrol Nanoemulsion on the Staphylococcus aureus and Escherichia coli Mixed Biofilms Formation
编辑推荐：
本研究创新性地制备了肉桂醛(CA)与香芹酚(CV)的复方纳米乳(CA/CV NEs)，深入探讨了其对临床常见混合病原体——金黄色葡萄球菌(S. aureus)与大肠杆菌(E. coli)混合生物膜形成的协同抑制效应。通过体外体内实验证实，该纳米乳体系不仅能协同增效，降低最低抑菌浓度(MIC)，更能通过抑制细菌粘附、运动性，降低胞间多糖黏附素(PIA)合成，干扰群体感应信号分子LuxS/AI-2表达，多通路破坏生物膜形成，为防治日益严峻的医疗器械相关混合生物膜感染提供了基于植物精油的纳米策略，具有良好的转化潜力。
1 引言
细菌生物膜是由胞外聚合物(EPS)包裹形成的三维细菌群落结构，为细菌抵抗抗菌剂和免疫清除提供了屏障，使得感染治疗复杂化。临床中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)与大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)常被同时检出，二者可形成混合生物膜。由于EPS成分的协同积累和信号分子的交叉调控，混合生物膜比单一物种生物膜表现出更高的稳定性和耐药性，导致治疗难度增加。抗生素的过度使用加速了细菌耐药性的发展，而植物来源的精油因其生物相容性和强大的抗菌特性受到关注。其中，肉桂醛(cinnamaldehyde, CA)和香芹酚(carvacrol, CV)在抑制S. aureus或E. coli生物膜形成方面显示出潜力，但存在水溶性差、挥发性强等应用挑战。纳米乳可增强疏水性抗菌剂的溶解度和稳定性，而抗菌剂的联合应用已证明可显著增强抗菌效果。因此，本研究旨在探究CA与CV在抑制S. aureus和E. coli混合生物膜形成方面的协同效应，并制备相应的纳米乳(CA/CV NEs)以提升其效能。
3.1 CA与CV的协同效应
体外混合S-E菌在共孵育24小时后倾向于形成生物膜。研究表明，CA与CV的组合显著增强了对S-E的抗菌活性(FICI = 0.3125)，其抗菌效果优于CA(256 μg/mL)或CV(256 μg/mL)单独使用，证明了协同抗菌活性。同时，在不同质量比(CA/CV = 1:1, 2:1, 4:1, 1:2)下，抑制S-E生物膜形成的Q值在1.15 ~ 2.5之间，表明其对抑制S-E生物膜形成具有协同效应。其中，质量比为4:1时Q值最高，因此选择此比例的组合(记为CA/CV)进行后续研究。
3.2 CA/CV纳米乳的制备与表征
为克服CA/CV水溶性低、挥发性高的缺点，采用高速乳化法制备了CA/CV纳米乳(CA/CV NEs)。优化后的制备工艺为：吐温80比例为8% (v/v)，油相比例为6% (m/v)，均质速度10000 rpm，均质时间6分钟。优化后的纳米乳粒径为43.3 ± 0.005 nm，多分散指数(PDI)为0.183 ± 0.006，zeta电位为-7.47 ± 0.39 mV。透射电镜(TEM)图像显示其呈球形形态。在4°C下储存30天后，纳米乳的粒径和外观无明显变化，表现出良好的稳定性。高效液相色谱(HPLC)测定显示，CA和CV的负载效率分别为90%和97.5%，负载量分别为43.2 mg/mL和11.7 mg/mL。
3.3 CA/CV纳米乳对细菌生物膜形成的抑制作用
与游离的CA/CV组合相比，CA/CV NEs对S-E的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)均降低至128 μg/mL。时间-生长曲线表明，在1/8 ~ 1/2 MIC (16 ~ 64 μg/mL)浓度范围内，纳米乳对S-E的生长影响轻微。CA/CV NEs以浓度依赖的方式抑制S-E混合生物膜的形成。即使在32 μg/mL (1/4 MIC)的低浓度下，也显示出显著的抑制效果，抑制率达到17.3%。在64 μg/mL (1/2 MIC)浓度下，结晶紫染色显示，对照组有致密、深紫蓝色染色，表明形成了厚实的生物膜；而CA/CV和CA/CV NEs则显著降低了染色强度。定量分析显示，CA/CV NEs组的生物膜抑制率进一步提升至40.24 ± 0.69%。扫描电镜(SEM)观察显示，对照组形成了厚实的S-E混合生物膜；经CA或CV单独处理后，生物膜变薄、瓦解，但仍可观察到明显的细菌聚集；而在CA/CV NEs处理组，仅观察到轻微的细菌聚集，且残留的金黄色葡萄球菌数量远多于大肠杆菌。这种增强的抑制效果应归因于纳米乳增加了细菌对其的摄取。
3.4 CA/CV纳米乳抑制细菌粘附
细菌粘附是生物膜形成过程的第一阶段。研究表明，CV不影响S-E的粘附，CA有轻微的抑制效果。相比之下，CA/CV和CA/CV NEs由于CA与CV的协同作用，显著抑制了S-E的粘附。值得注意的是，CA/CV NEs组的相对抑制率达到41.83 ± 0.78%。细菌运动性有利于细菌定植，并可促进生物膜形成。LB琼脂平板实验结果显示，纳米乳能显著抑制混合S-E的扩散，相对抑制率约为16%。胞间多糖黏附素(Polysaccharide intercellular adhesin, PIA)是生物膜的关键成分，可促进细菌粘附。刚果红琼脂平板实验显示，对照组和CV组菌落呈黑色(PIA阳性)；CA处理后菌落颜色略浅；CA/CV和CA/CV NEs组菌落颜色比CA组更浅。定量分析PIA含量显示，CA/CV NEs组(40 ± 0.81 μg/mL)的PIA浓度显著低于对照组(55 ± 0.82 μg/mL)和CA/CV组(46 ± 0.82 μg/mL)。结果表明，CA/CV组合，尤其是纳米乳形式，能显著抑制S-E生物膜中PIA的合成，从而通过抑制粘附过程减少生物膜形成。
3.5 CA/CV纳米乳通过LuxS/AI-2系统影响EPS产生以发挥抗生物膜活性
胞外蛋白是生物膜基质的主要成分。监测不同处理后胞外蛋白量的变化发现，与CA(68.85 ± 1.08 μg/mL)或CV(74.08 ± 1.42 μg/mL)单独使用相比，CA/CV和CA/CV NEs能显著减少胞外蛋白的分泌，浓度分别降至50.87 ± 1.60和42.06 ± 1.80 μg/mL。这表明CA/CV NEs能有效减少生物膜的胞外蛋白。自诱导剂-2 (Autoinducer-2, AI-2)群体感应系统在革兰氏阳性和阴性细菌中普遍存在，并能显著促进金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生物膜形成。因此，研究通过qRT-PCR检测了CA/CV NEs对S-E混合生物膜中AI-2合成关键酶LuxS基因表达的影响。结果显示，与CA或CV单独处理组相比，CA/CV和CA/CV NEs组的LuxS表达显著下调。这种下调导致AI-2产量减少。与基因表达结果一致，CA/CV NEs处理后AI-2含量降低了53.97 ± 1.59%，远高于其他处理组。结果表明，CA/CV NEs可通过下调LuxS来减少AI-2的产生。
3.6 CA/CV纳米乳在体内对S-E生物膜形成的抑制作用
基于体外结果，通过小鼠植入物S-E感染模型评估了CA/CV NEs在体内对S-E混合生物膜形成的抑制作用。在小鼠皮下植入无菌医用导管后注射S-E菌悬液，连续7天在感染部位皮下注射PBS、游离CA、游离CV、CA/CV混合物或CA/CV NEs。第8天取出植入物，通过平板计数法评估导管表面的细菌数量，并使用SEM观察导管表面生物膜的形成。平板计数结果显示，CA/CV NEs处理后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌落数显著减少。定量结果显示，对于金黄色葡萄球菌，CA/CV和CA/CV NEs组的细菌数量分别减少了1.26 ± 0.03 log10和1.75 ± 0.10 log10；对于大肠杆菌，则分别减少了0.76 ± 0.23 log10和1.39 ± 0.25 log10。SEM观察显示，对照组导管表面形成了致密、厚实的生物膜，且其中金黄色葡萄球菌占多数；而在CA/CV NEs组，仅观察到少量细菌聚集。所有结果证明，CA/CV NEs能在体内有效抑制S-E生物膜的形成。此外，细菌感染通常伴有严重的炎症反应。检测小鼠血清中的促炎因子发现，TNF-α和IL-6的含量显著降低。周围皮肤组织的H&E染色图像也显示，CA/CV NEs组的炎症细胞浸润显著减少，表明炎症得到缓解。
3.7 CA/CV纳米乳的安全性评价
以蒸馏水为阳性对照、生理盐水为阴性对照评估了CA/CV NEs的溶血活性。在治疗所用浓度(128 μg/mL和64 μg/mL)下，溶血率低于5%，表明CA/CV NEs在所用剂量下具有良好的血液相容性。血液学安全性评估显示，CA/CV NEs组小鼠的白细胞计数(WBC)、血细胞比容(HCT)和血小板计数(PLT)与对照组无显著差异。组织病理学分析显示，心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等主要器官未观察到显著的病理变化。对药物代谢关键器官肝脏和肾脏的安全性评估测试了血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)。数据显示，CA/CV NEs组小鼠的上述生化参数始终处于正常生理范围内，表明CA/CV NEs未对小鼠肝、肾造成损伤。所有结果表明，CA/CV NEs在伤口治疗期间具有良好的体内安全性。
4 结论
总之，本研究构建并优化了具有协同抑制S-E混合生物膜形成的CA/CV纳米乳。与游离CA/CV相比，其对混合生物膜的抑制活性显著增强。CA/CV NEs通过抗细菌粘附、减少PIA和胞外蛋白的产生、抑制LuxS/AI-2通路来抑制混合生物膜的形成。在植入物感染模型中，CA/CV NEs能有效抑制S-E生物膜的形成，同时降低细菌负荷。本研究为利用中药活性成分防治混合生物膜相关感染提供了新策略和新视角。
