《Cancer Research》：Transfer of Damaged Mitochondria from Cancer Cells to Cancer-Associated Fibroblasts Promotes Tyrosine Kinase Inhibitor Tolerance in EGFR-Mutant Lung Cancer
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本研究揭示，携带EGFR突变的肺腺癌细胞在靶向药（EGFR-TKI）压力下，会将受损的线粒体通过隧道纳米管（TNT）传递给一类名为RGS5+MYL9+的癌症相关成纤维细胞（CAF）。CAF扮演“代谢垃圾桶”角色，帮助肿瘤细胞清除线粒体损伤和活性氧（mtROS），从而促进药物耐受持久性细胞（DTP）存活并导致耐药复发。抑制TNT形成或阻断线粒体转移，可有效恢复肿瘤对奥希替尼的敏感性。这项研究发现了可靶向的基质-肿瘤互作新机制，为克服肺癌靶向耐药提供了新的联合治疗策略。
CAF亚群在EGFR突变肺腺癌中的鉴定与临床意义
为了阐明癌症相关成纤维细胞（CAF）在肺腺癌（LUAD）中对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）耐药的作用机制，研究者对6例未经治疗的EGFR突变肺腺癌患者的肿瘤样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。分析鉴定出五个不同的CAF亚群，包括三个新的肌成纤维细胞（myCAF）亚群：BCHE+myCAF、PTGDS+myCAF和RGS5+myCAF。通过建立患者来源类器官（PDO）与匹配CAF的三维共培养模型（PDO-CAF模型）并进行药物测试，发现RGS5+MYL9+myCAF和炎症性CAF（iCAF）能显著减弱第三代EGFR-TKI奥希替尼（osimertinib）诱导的细胞死亡，并促进药物洗脱后的肿瘤再生。临床样本分析进一步证实，在奥希替尼耐药的肺腺癌组织中，肿瘤浸润的RGS5+MYL9+CAF更为富集。来自癌症基因组图谱（TCGA）的数据显示，RGS5+MYL9+CAF的高浸润与EGFR突变肺腺癌患者的较差预后显著相关。
RGS5+MYL9+CAF通过减轻线粒体损伤促进DTP形成
研究利用EGFR突变肺腺癌细胞系（HCC827和PC9）和患者来源的CAF亚群进行共培养。结果显示，与RGS5+MYL9+CAF共培养，能显著增强肿瘤细胞在奥希替尼处理后的活力、干细胞特性、上皮-间质转化（EMT）标志物表达，并诱导其进入慢增殖的药物耐受持久性（DTP）状态。这种促耐药作用依赖于细胞间的直接接触。转录组测序（RNA-seq）分析发现，与RGS5+MYL9+CAF共培养的DTP细胞，其氧化磷酸化和活性氧（ROS）相关通路被显著下调。进一步的线粒体功能分析表明，RGS5+MYL9+CAF能保护肺腺癌细胞免受奥希替尼诱导的线粒体膜电位（ΔΨm）下降、线粒体活性氧（mtROS）积累和线粒体结构损伤。有趣的是，共培养体系中的RGS5+MYL9+CAF自身却表现出线粒体功能障碍（mtROS升高，ΔΨm降低），提示其可能通过接纳肿瘤细胞的氧化应激来创造保护性微环境。小鼠皮下移植瘤模型实验验证了上述发现，RGS5+MYL9+CAF能促进奥希替尼治疗后的最小残留病灶（MRD）形成和药物撤除后的肿瘤复发，同时肿瘤细胞线粒体损伤减轻，而CAF自身线粒体损伤加重。
细胞间纳米管介导受损线粒体从肺腺癌细胞向RGS5+MYL9+CAF转移
鉴于RGS5+MYL9+CAF的促耐药作用依赖于直接接触，研究者探究了细胞间隧道纳米管（TNT）的作用。共培养体系的共聚焦显微镜成像显示，在奥希替尼处理的肺腺癌细胞与RGS5+MYL9+CAF之间形成了大量的TNT，并且可见线粒体沿着TNT从肿瘤细胞向CAF转移。而与其他CAF亚群共培养时，这种转移现象极少。流式细胞术定量分析证实，与RGS5+MYL9+CAF共培养时，从肿瘤细胞转移到CAF的线粒体数量显著更高，且这些被转移的线粒体具有更高的mtROS水平。使用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D（cytochalasin D）可有效阻断线粒体转移，而间隙连接抑制剂18-α-GA或内吞作用抑制剂dynasore则无此效果，表明线粒体转移主要通过TNT介导。体内小鼠模型实验同样观察到，在奥希替尼治疗期间，携带红色荧光标记线粒体（mitoDsRed）的肿瘤细胞会将受损线粒体转移给绿色荧光蛋白（GFP）标记的RGS5+MYL9+CAF。
mtROS上调Miro1驱动受损线粒体向CAF周边分布
研究者进一步探索了肿瘤细胞内受损线粒体如何定向迁移至与CAF接触的细胞周边。线粒体Rho GTP酶1（Miro1）是调控线粒体运动的关键蛋白。研究发现，在奥希替尼处理下，与RGS5+MYL9+CAF共培养的肿瘤细胞内，受损线粒体逐渐从核周区域向细胞外围（靠近CAF一侧）重新分布，并且Miro1蛋白表达上调且与线粒体共定位于外围。敲低Miro1或使用mtROS清除剂mitoTEMPO均可逆转这种线粒体的外围分布和Miro1的上调。这表明，奥希替尼压力下产生的mtROS上调了Miro1的表达，从而驱动受损线粒体向肿瘤细胞-基质界面迁移，为通过TNT向CAF转移做好了准备。
CCL11招募RGS5+MYL9+CAF至DTP生态位并激活RhoA
为了解RGS5+MYL9+CAF如何被募集至耐药肿瘤细胞周围，研究者进行了细胞因子阵列和酶联免疫吸附试验（ELISA）。发现奥希替尼处理的肺腺癌细胞分泌的趋化因子CCL11水平显著升高。体外趋化实验和体内小鼠模型均证实，CCL11能特异性招募RGS5+MYL9+CAF。使用CCL11中和抗体（αCCL11）可阻断这种招募，并增强奥希替尼的疗效。机制上，CCL11通过其受体CCR3激活肿瘤细胞内的Ras同源基因家族成员A（RhoA）。活化的RhoA（GTP-RhoA）进一步促进了肌动蛋白细胞骨架的重排和TNT的形成，为线粒体转移提供了结构基础。
靶向纳米管介导的线粒体转移克服EGFR-TKI耐药
基于上述机制，研究评估了靶向这一通路的治疗潜力。Rho激酶（ROCK）是RhoA的关键下游效应器。研究者使用了FDA已批准的Rho激酶抑制剂法舒地尔（fasudil）。体外实验表明，法舒地尔能有效抑制共培养体系中TNT的形成和线粒体转移，并恢复肿瘤细胞对奥希替尼的敏感性。在体内小鼠模型中，奥希替尼与法舒地尔的联合治疗，与单用奥希替尼相比，能更有效地抑制肿瘤生长、减少MRD形成、延缓肿瘤复发并显著延长荷瘤小鼠的总生存期。
结论
本研究系统揭示了EGFR突变肺腺癌中一种全新的基质介导的靶向药耐药机制。奥希替尼治疗诱导肿瘤细胞产生mtROS并分泌CCL11，后者将RGS5+MYL9+CAF募集至DTP生态位。mtROS上调Miro1，与CCL11/CCR3轴激活的RhoA协同作用，驱动肿瘤细胞形成TNT，并将受损的线粒体“垃圾”卸载给CAF。CAF通过充当“代谢垃圾桶”，帮助肿瘤细胞减轻线粒体损伤和氧化应激，从而促进其存活并进入耐药的DTP状态。靶向这一互作过程，特别是使用法舒地尔抑制ROCK来阻断TNT形成和线粒体转移，能与奥希替尼产生协同作用，为临床克服EGFR-TKI耐药提供了具有转化潜力的新策略。
