通过CsPbBr、3@COF-LZU1@AuNP电化学发光技术和Cas13a扩增方法，对SARS-CoV-2 3CLpro生物标志物进行基于实验阶段的定量分析

《Talanta》：Stage-aware quantification of the SARS-CoV-2 3CLpro biomarker via CsPbBr 3@COF-LZU1@AuNP electrochemiluminescence and Cas13a amplification

该研究开发了一种基于水稳定CsPbBr3@COF-LZU1发射体的电化学发光（ECL）生物传感器，集成肽-DNA构象开关与CRISPR/Cas13a扩增技术，实现SARS-CoV-2主蛋白酶（3CLpro）活性的高灵敏度“turn-on”检测，检测限达4.31 aM，并成功应用于临床咽拭子样本的分期诊断。

　　

余电波|任浩珍|何鹏远|李文波|唐前丽|黄龙健|魏继华|张凯|廖先久

广西民族医科大学附属医院骨与关节退行性疾病临床前与转化研究重点实验室，中国广西百色，533000

摘要

在复杂基质中，直接基于活性的SARS-CoV-2主要蛋白酶（3CL^pro）定量仍然具有挑战性。本文报道了一种水兼容的电化学发光（ECL）生物传感器，该传感器结合了CsPbBr₃@COF-LZU1发射体、肽-DNA构象开关以及CRISPR/Cas13a辅助扩增技术，将蛋白酶活性转化为稳健的光学“开启”信号。共价有机框架在水性介质中物理稳定了钙钛矿纳米晶体，并与稀疏的金纳米粒子层一起，支持铁烯终止报告分子的组装，通过近场/氧化还原淬灭作用实现超低基线。目标特异性切割释放出一个启动子，驱动熵介导的T7启动子形成和转录，产生激活Cas13a的RNA；去除或远离发射体的铁烯可恢复光子输出。在优化条件下，该传感器在10至10⁸ aM范围内表现出宽的对数线性响应，检测限低至4.31 aM，对常见干扰物具有高分析选择性，制造精度高（电极间RSD约为3%），并且具有实用的稳健性（在4°C下12小时后信号保留率约为97%，7天后约为90%，120次ECL循环后约为92%）。逐步ECL、循环伏安法和阻抗分析证实了逐层组装以及铁烯介导的淬灭和Cas13a驱动的恢复机制。该平台直接应用于经过最小处理的咽拭子提取物，能够分辨不同疾病阶段的群体差异，并捕捉到晚期样本中3CL^pro活性的预期衰减，支持在实际临床样本中进行阶段感知的定量分析。这种模块化设计——可在蛋白酶可切割基序、启动子模板和crRNA处重新编程——为敏感、选择性和水稳定的ECL酶活性检测提供了一条通用途径。

引言

基于活性的生物传感器能够报告酶功能而不仅仅是分析物的浓度，因此在早期诊断和药物筛选中越来越受到重视。在病毒蛋白酶中，冠状病毒的主要蛋白酶（3CL^pro，也称为M^pro）是一个经过验证的治疗靶点，其催化活性与病毒复制相关[1]。因此，能够在复杂基质中快速、灵敏且选择性地检测3CL^pro活性，将有助于及时评估感染或蛋白酶抑制情况，而无需依赖抗体的可用性或完整的病毒基因组。然而，传统的荧光检测方法受到光学背景、光漂白和笨重仪器的限制，而电化学方法则可能受到基质干扰和有限转导增益的挑战[2]；[3]。

电化学发光（ECL）通过偏置电极上的电化学反应产生光子，从而消除了外部激发光并最小化了自荧光[[4], [5], [6], [7]]。金属卤化物钙钛矿，特别是CsPbBr₃纳米晶体，是一种有前景的ECL发射体，因为它们具有高效的辐射复合、接近520 nm的窄发射峰和易于调节的表面[8]。然而，它们在水性电解质中的不稳定性以及与生物功能层直接接口时的电荷注入效率低下是其在分析应用中的主要障碍。将CsPbBr₃限制在结晶共价有机框架（COFs）内提供了一种结构解决方案：刚性的多孔COF-LZU1支架在空间上稳定了钙钛矿，并为离子和电子创建了渗透路径，实现了稳健且水兼容的ECL，同时保持了高发射效率[[9], [10], [11]]。因此，该平台非常适合在同一电极上进行生物识别和信号处理化学反应。

为了将分子识别转化为大的光学响应，我们将钙钛矿发射体与距离和氧化还原控制的淬灭剂耦合在金纳米界面处。具体来说，玻璃碳电极（GCE）涂覆了一层薄的CsPbBr₃@COF-LZU1，并覆盖了一层稀疏的金纳米粒子（AuNPs）。AuNPs作为硫醇化DNA报告分子的锚定点，这些报告分子的末端是铁烯（Fc），这是一种众所周知的ECL淬灭剂和电子介质。在完整状态下，Fc与钙钛矿层之间的紧密接近通过近场能量转移（ECL-RET）和/或竞争性氧化还原途径抑制了光输出，从而建立了低基线。切割或分离Fc标记的报告分子与界面后，ECL被恢复，产生敏感的“开启”信号。

目标识别和生化扩增是通过整合一个构象锁定的肽-DNA纳米结构与CRISPR/Cas13a来协调的。肽结构包含一个可被3CL^pro切割的基序，并在肽-DNA杂交体（CLIP）中机械锁定一个启动子DNA链。在没有蛋白酶的情况下，启动子被隔离，下游反应被动力学阻断。当暴露于活性3CL^pro时，肽切割释放启动子单链DNA[12]。这个启动子触发一个熵驱动的链交换电路，无需酶即可组装出功能性的T7启动子，随后由T7 RNA聚合酶进行等温转录，生成大量的RNA转录本[[13], [14], [15]]。这些转录本通过预设计的CRISPR RNA（crRNA）的序列特异性识别激活CRISPR/Cas13a（规律间隔短回文重复序列相关核酸酶）。激活的Cas13a表现出强大的旁路核糖核酸酶活性，无差别地切割附近的含尿苷核酸[5]。

我们通过在每个表面连接的DNA报告分子（5′-HS–DNA–rU–rU–Spacer–Fc-3′）中编码两个核糖尿苷（rU）来利用这种旁路活性。当Cas13a反应混合物接触电极时，激活的核酸酶切割rU位点，切断Fc标记的片段或将它们从钙钛矿界面移开。由此增加的发射体-淬灭剂距离和去除竞争性电子汇点共同在基于过硫酸盐（S₂O₈^2?）的阴极工作模式下放大了ECL强度。由于每个上游生化步骤——蛋白酶切割、熵驱动的组装、T7转录和Cas13a激活——都放大了信号，因此低水平的3CL^pro活性被转化为易于测量的光学输出，且具有高特异性。

在这里，我们提出了一种钙钛矿-生物大分子杂化ECL生物传感器，它整合了（i）一种水稳定的CsPbBr₃@COF-LZU1发射体，用于高效、低背景的光子生成；（ii）一种由AuNP支持的Fc标记DNA报告分子，将分子事件转化为距离和氧化还原控制的ECL调制；以及（iii）一种与熵驱动/T7/Cas13a扩增耦合的肽-DNA构象锁，用于基于活性的3CL^pro识别。所提出的架构在稳健的GCE基底上运行，使用容易获得的试剂，并在蛋白酶底物和crRNA序列上提供了模块化，使其能够适应其他蛋白酶或核酸靶点。我们证明了这种设计在复杂样品中具有宽动态范围、低检测限和强选择性，突显了其在快速蛋白酶筛选、抗病毒药物评估和即时诊断方面的潜力。

部分摘录

化学品和试剂

溴化铯（CsBr）、溴化铅（PbBr₂）、K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆）、KCl、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇、磷酸盐缓冲盐水（PBS，10 mM，pH 7.4）、三（2-羧乙基）膦（TCEP）、6-巯基-1-己醇（MCH）和牛血清白蛋白（BSA）均为分析级。氯金酸（HAuCl₄·3H₂O）、T7 RNA聚合酶和rNTPs、Cas13a及其缓冲液和crRNA、重组3CL^pro以及GC376均从商业供应商处获得。整个实验过程中使用了超纯水（18.2 MΩ cm）。

所提出的ECL生物传感器原理

所提出的生物传感器通过整合一种水稳定的钙钛矿发射体、对蛋白水解响应的肽-DNA启动子以及CRISPR/Cas辅助的核酸扩增级联反应，将3CL^pro的酶活性转化为“开启”的电化学发光（ECL）响应。

如图1A所示，传感平台由限制在结晶共价有机框架（COF）内的CsPbBr₃纳米晶体构成。这种CsPbBr₃@COF-LZU1杂化结构改善了界面

结论

我们开发了一种水兼容的、基于活性的ECL生物传感平台，它将CsPbBr₃@COF-LZU1发射体与肽-DNA构象开关和CRISPR/Cas13a扩增相结合，将3CL^pro活性转化为稳健的“开启”光学读数。COF支架在水性介质中物理稳定了钙钛矿纳米晶体，并与稀疏的金纳米粒子层一起，提供了一个导电且生物正交的界面，用于组装Fc终止的核酸报告分子，从而实现

CRediT作者贡献声明

余电波：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原始草稿，监督，项目管理，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。任浩珍：软件，资源，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。何鹏远：验证，监督，软件，项目管理，资金获取，正式分析，数据管理。李文波：监督，资源，项目管理，研究，资金

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

我们衷心感谢广西自然科学基金（2025GXNSFHA069115）、广西骨与关节退行性疾病基础与转化研究重点实验室（2022-06-20-2205）、百色生物分析化学与临床分子诊断重点实验室（2022-05-22）、百色生物分析化学应用与临床分子诊断工程研究中心（2021-22-09）的财政支持。