《Molecular Cancer Therapeutics》：Plasminogen Activator Inhibitor-1 Mediates Tolerance to Anti–PD-1 Immunotherapy in Non–Small Cell Lung Cancer
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本期推荐：免疫检查点抑制剂（ICI）虽改善了非小细胞肺癌（NSCLC）患者预后，但治愈率仍低，主要因治疗过程中存在“耐受性持久细胞”。本文揭示，纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）是这种耐受性的关键介质，其通过诱导上皮-间质转化（EMT）和重塑肿瘤免疫微环境（TIME）帮助癌细胞存活。研究证实，使用PAI-1抑制剂TM5614联合抗PD-1（aPD-1）治疗，可有效逆转耐受、抑制肿瘤生长，为克服NSCLC免疫治疗耐药提供了新策略。
引言
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85%。对于无靶向驱动突变的晚期NSCLC患者，标准一线治疗是细胞毒性化疗联合靶向PD-L1或PD-1的免疫检查点抑制剂（ICI）。然而，仅有一小部分患者能被治愈，超过一半的患者在治疗开始后1年内出现疾病进展。疾病进展的部分原因在于NSCLC细胞获得了对ICI治疗的抵抗性。已报道的机制包括肿瘤抗原耗竭、T细胞功能障碍、免疫抑制细胞数量增加以及肿瘤细胞内PD-L1表达的改变。
此外，癌细胞经历上皮-间质转化（EMT），获得对淋巴细胞裂解的抵抗性。EMT诱导的细胞表达高水平的转化生长因子-β（TGF-β），后者促进免疫抑制性肿瘤免疫微环境（TIME）的形成。近来，药物耐受持久癌细胞（DTP）被认为是导致后续肿瘤再生长的一个原因，这些细胞在治疗期间存活于肿瘤内，并表现出可逆的抵抗性。越来越多的证据表明，DTP细胞可以重编程多种细胞过程，包括表观遗传调控、转录、翻译和代谢，以在治疗压力下维持生存。此外，近期研究还涉及胰岛素样生长因子-1受体信号传导、组蛋白去甲基化酶和癌细胞EMT的参与。
纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）是一种由多种细胞产生的47 kDa糖蛋白，是纤溶系统的抑制剂。PAI-1也被报道参与全身性炎症、动脉粥样化以及肺和肾的纤维化。此外，肿瘤组织中高PAI-1表达已被确定为不仅是NSCLC，也是其他癌症类型的不良预后因素，其参与肿瘤进展已有描述。先前研究报道，在肺癌细胞中，PAI-1通过EMT促进对化疗的获得性抵抗，而EMT是抗PD-1（aPD-1）抗体治疗的抵抗机制之一。研究还报道，PAI-1与奥希替尼治疗的EGFR突变NSCLC细胞中通过EMT出现的DTP有关。基于这些发现，PAI-1可能是影响aPD-1抗体治疗耐受性的一个重要因素。
TM5614是一种PAI-1抑制剂，是基于人PAI-1晶体结构进行计算机模拟药物发现，从1400多种新型衍生物中筛选出的小分子药物。在健康个体中的I期试验以及慢性粒细胞白血病和2019冠状病毒病（COVID-19）的II期试验已表明，口服TM5614具有良好的耐受性和安全性。近期一项II期研究也显示了纳武利尤单抗联合TM5614治疗在纳武利尤单抗治疗期间发生疾病进展的黑色素瘤患者中的疗效和安全性。
基于这些发现，本研究旨在利用TM5614和小鼠肺癌模型，研究PAI-1是否参与aPD-1抗体治疗的NSCLC细胞中DTP的出现。此外，还探讨了将PAI-1作为克服这种耐受性的治疗靶点的可能性，以及aPD-1抗体与TM5614联合治疗是否可成为NSCLC的新治疗策略。
材料与方法
本研究使用了小鼠肺腺癌细胞系Lewis肺癌（LLC）、小鼠肺鳞状细胞癌细胞系KLN205、人肺成纤维细胞系MRC-5和小鼠巨噬细胞系Raw264.7。细胞在补充了7.5%胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基中，于37°C、5% CO2的加湿培养箱中培养。TM5614在体内实验中用羧甲基纤维素钠溶解，在体外实验中用DMSO溶解。在体外实验中，TM5614的给药浓度为62.7 μmol/L。使用了IgG2a同种型对照抗体和aPD-1抗体。通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、微阵列测试、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、免疫组织化学（IHC）染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）和增殖测定等方法进行了分子和细胞水平分析。建立了小鼠皮下肿瘤模型，当肿瘤大小达到约200 mm3时开始治疗。TM5614（10 mg/kg）每天口服灌胃给药。IgG2a同种型对照抗体或aPD-1抗体每3天腹腔注射一次，剂量为250 μg。还回顾性分析了接受手术的NSCLC患者的临床样本。所有结果以平均值±标准误表示，使用曼-惠特尼U检验进行两组比较，使用单因素方差分析（ANOVA）和图基检验进行三组或以上比较。统计学显著性设定为P< 0.05。
结果
PAI-1在aPD-1抗体治疗早期耐受性持久NSCLC细胞中的表达水平
为了研究aPD-1抗体耐受持久细胞（aPD-1-TP）在aPD-1抗体治疗早期肿瘤中的PAI-1表达水平，研究建立了使用LLC和KLN205细胞的皮下肿瘤模型，并给予aPD-1抗体或IgG2a同种型对照抗体。肿瘤生长在治疗开始后第7天之前受到相对抑制，之后肿瘤开始更快生长。因此，将aPD-1抗体治疗7天后仍存活于肿瘤内的癌细胞定义为aPD-1-TP。微阵列分析显示，在LLC和KLN205肿瘤模型中，aPD-1治疗组的TGF-β信号通路均上调。鉴于TGF-β已被报道可诱导PAI-1表达并促进癌细胞EMT，研究接下来聚焦于PAI-1和EMT相关基因的表达。
两个模型的微阵列分析均表明，aPD-1组表现出PAI-1和间质标志物表达上调，上皮标志基因表达下调。
qRT-PCR也显示，aPD-1抗体治疗的LLC肿瘤中PAI-1 mRNA表达水平显著高于对照肿瘤。肿瘤切片的IHC染色表明，aPD-1抗体治疗的LLC肿瘤中PAI-1阳性区域显著大于对照肿瘤。这些结果表明，aPD-1-TP中的PAI-1蛋白表达水平显著高于对照细胞。此外，在KLN205细胞皮下肿瘤模型中，aPD-1抗体治疗的肿瘤中PAI-1 mRNA表达水平也显著高于对照肿瘤。肿瘤切片的IHC染色也显示，aPD-1-TP中的PAI-1蛋白表达水平显著高于对照细胞。这些结果表明，aPD-1-TP表达的PAI-1水平显著高于对照细胞。
随后，为了研究肿瘤大小是否与癌细胞中PAI-1表达相关，比较了治疗开始后第7天收集的肿瘤（小肿瘤组）与肿瘤生长后较晚时间点收集的肿瘤（大肿瘤组）的PAI-1水平。qRT-PCR显示，LLC肿瘤中PAI-1 mRNA表达水平在大肿瘤组显著高于小肿瘤组。肿瘤切片IHC染色显示，大肿瘤组的PAI-1阳性区域比例显著大于小肿瘤组。在使用KLN205细胞的实验中也观察到了类似结果。这些发现表明，在aPD-1抗体治疗期间，随着肿瘤增大，癌细胞中的PAI-1表达有增加趋势。
人NSCLC标本在aPD-1抗体治疗后高表达PAI-1
为了研究PAI-1高表达是否也发生在人NSCLC中，比较了接受与未接受aPD-1抗体治疗的手术切除NSCLC标本中PAI-1表达的差异。尽管样本量小且对潜在混杂因素的调整不足限制了分析，但IHC染色显示，接受aPD-1抗体治疗的NSCLC标本中PAI-1表达显著高于对照组。
TM5614对aPD-1治疗抗肿瘤疗效的影响
给予aPD-1抗体暂时抑制了LLC细胞皮下肿瘤的生长，但大约在第30天观察到了肿瘤再生长。研究随后检验了抑制在aPD-1-TP中高表达的PAI-1是否能抑制后续的肿瘤再生长。研究了TM5614（一种已知可促进PAI-1蛋白降解的小分子PAI-1抑制剂）的治疗潜力。TM5614在之前的tPA依赖性水解测定中的IC50值<6.95 μmol/L。结果显示，TM5614组上清液中的PAI-1蛋白水平显著低于对照组。关于TM5614联合aPD-1疗法的体内抗肿瘤疗效，在aPD-1抗体+TM5614组未观察到肿瘤再生长。在KLN205细胞皮下肿瘤中也观察到了类似结果。
鉴于TM5614的作用是通过PAI-1降解实现的，接下来检验了TM5614治疗是否降低了肿瘤内的PAI-1表达。IHC分析显示，TM5614治疗组肿瘤组织中的PAI-1表达降低。随后，研究了TM5614对肺癌细胞系体外的抗增殖作用。TM5614在LLC和KLN205模型中均显著抑制了肿瘤细胞增殖。总之，这些发现表明，TM5614降低了肿瘤内的PAI-1水平，并对癌细胞增殖产生抑制作用。此外，PAI-1参与了aPD-1治疗期间aPD-1-TP的存活及后续的肿瘤再生长。
为了排除TM5614对PAI-1以外的分子产生脱靶效应的可能性，使用另一种PAI-1抑制剂SK-216进行了额外的实验。结果表明，与使用TM5614的实验结果相似。特别是，与aPD-1单药治疗相比，aPD-1联合SK-216治疗在LLC和KLN205模型中均表现出显著更好的抗肿瘤疗效。这些发现表明，PAI-1有助于aPD-1-TP的存活。重要的是，TM5614抑制PAI-1显著增强了aPD-1单药治疗的疗效，且TM5614的活性对PAI-1具有特异性。
PAI-1参与aPD-1治疗期间aPD-1-TP的EMT
微阵列结果显示，aPD-1抗体组间质基因表达更高，上皮基因表达低于对照组。这些发现表明aPD-1-TP通过诱导EMT而持续存在。qRT-PCR也显示，与对照组相比，aPD-1抗体组的上皮基因表达显著降低，间质基因表达显著升高。相反，aPD-1抗体+TM5614组的间质基因表达显著低于aPD-1抗体组。在KLN205细胞的肿瘤中也观察到了类似结果。这些发现支持PAI-1参与了aPD-1治疗期间aPD-1-TP的EMT，且TM5614抑制了aPD-1抗体治疗的NSCLC细胞的EMT。
为了研究TM5614是否在较晚时间点抑制EMT，比较了第36天aPD-1抗体组与aPD-1抗体+TM5614组之间EMT相关基因的表达。aPD-1抗体+TM5614组的间质基因表达显著低于aPD-1抗体组。在使用KLN205细胞的小鼠肺癌模型中也观察到了类似结果。这些发现表明，TM5614在较
