《Genes & Diseases》：Single-cell RNA sequencing reveals FOLR2+ macrophages interaction with HSPA6+ NSCLC cells via CCL2/ICAM-1 in malignant pleural effusion and promotes
EGFR-TKI resistance
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EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药是非小细胞肺癌（NSCLC）临床治疗的重要瓶颈。本研究对患者恶性胸腔积液和血液样本进行单细胞RNA测序，解析了耐药后肿瘤微环境的细胞组成与互作网络，揭示了FOLR2+的M2样巨噬细胞通过CCL2/ICAM-1通路与具有干细胞特性的HSPA6+癌细胞互作，共同驱动奥希替尼耐药。该发现为理解EGFR-TKI耐药新机制提供了视角，并为逆转耐药提供了潜在治疗靶点。
肺癌是全球范围内死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌占据了绝大多数病例。对于携带表皮生长因子受体（EGFR）突变的患者而言，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）如奥希替尼，已成为一线标准治疗，显著延长了患者的生存期。然而，一个残酷的现实是，几乎所有患者最终都会对药物产生耐药，导致疾病进展。尽管科学家们已发现部分耐药机制，如EGFR基因的二次突变或旁路信号激活，但耐药的发生具有高度的异质性，许多谜团仍未解开。尤其是在肺癌患者常见的并发症——恶性胸腔积液（MPE）中，肿瘤细胞、免疫细胞等多种成分共存的特殊微环境，被认为是研究耐药机制的“富矿”，但其在EGFR-TKI耐药中的具体作用尚不清晰。为了深入探索耐药背后的细胞与分子全景，一项发表于《Genes》杂志的研究，利用前沿的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，为我们揭开了恶性胸腔积液中一场驱动耐药的关键细胞“对话”。
本研究采用了多项关键技术来解析耐药微环境。研究人员收集了8名非小细胞肺癌患者（2名治疗前，6名奥希替尼耐药后）的恶性胸腔积液和外周血单个核细胞（PBMC）样本。核心分析基于10x Genomics平台的单细胞RNA测序，通过Seurat软件包进行数据质控、整合、降维和细胞聚类分析。利用inferCNV算法通过拷贝数变异（CNV）评分鉴定恶性上皮细胞。细胞间通讯分析借助CellPhoneDB和NicheNet工具预测配体-受体互作。此外，研究还结合了体外细胞共培养、蛋白质免疫印迹（Western Blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、CCK-8细胞活性检测、肿瘤球形成实验以及多重免疫组化等技术进行功能验证。
研究结果
奥希替尼耐药后NSCLC的全局细胞图谱
通过对75,487个高质量单细胞的分析，研究绘制了耐药前后的细胞组成变化。结果显示，在恶性胸腔积液中，耐药后CD4+T细胞、自然杀伤（NK）细胞和髓系细胞比例增加，而树突状细胞比例降低。在外周血中，CD4+T细胞比例也增加，但NK细胞比例下降。这表明耐药导致了局部（胸腔积液）和系统（血液）免疫微环境的显著重塑。
恶性胸腔积液中恶性上皮细胞亚群的鉴定
通过CNV分析，研究人员从上皮细胞中鉴定出多个恶性亚群，并命名为malignant_CCL5、malignant_HSPA6等。其中，malignant_HSPA6亚群在奥希替尼耐药组中显著富集。轨迹分析和CytoTRACE评分显示，该亚群处于发育轨迹的起点，具有更高的干细胞特性（stemness）。基因集富集分析（GSEA）提示其功能与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）/核因子κB（NF-κB）信号通路相关。更重要的是，以该亚群前15个标志物构成的基因标签，在TCGA肺腺癌队列中预示了更差的预后。
PBMC和MPE中巨噬细胞亚型的多样性
对髓系细胞的深入分析揭示了9个巨噬细胞/单核细胞亚群。值得注意的是，一个表达叶酸受体2（FOLR2）的亚群——Macro_FOLR2，在耐药组的恶性胸腔积液中显著增多。表型评分显示Macro_FOLR2表现出更强的M2样巨噬细胞特征。GSEA分析表明其功能与体液免疫应答和上皮细胞增殖相关，提示它可能参与调节肿瘤微环境。
MPE中巨噬细胞与上皮细胞的相互作用
鉴于Malignant_HSPA6具有干细胞特性，而Macro_FOLR2可能调节上皮细胞增殖，研究人员推测两者间存在通讯。细胞互作分析（CellPhoneDB）证实，在所有的恶性上皮亚群中，Malignant_HSPA6是与Macro_FOLR2相互作用最强的亚群。进一步的配体-受体分析（NicheNet）预测，Macro_FOLR2可能通过分泌CCL2（也称为MCP-1）来作用于Malignant_HSPA6细胞，而ICAM-1（细胞间粘附分子-1）可能是CCL2下游的一个关键靶基因。
Macro_FOLR2通过CCL2/ICAM-1通路调控Malignant_HSPA6 NSCLC细胞以促进奥希替尼耐药
为了验证上述预测，研究团队构建了稳定过表达HSPA6的肺癌PC-9细胞株和过表达FOLR2的THP-1（单核细胞）细胞株进行体外共培养。功能实验表明，HSPA6过表达本身就能促进PC-9细胞的干细胞特性和奥希替尼耐药。当与FOLR2过表达的THP-1细胞共培养时，PC-9细胞对奥希替尼的耐药性进一步增强，迁移和增殖能力也提高。机制上，共培养体系上清液中的CCL2水平显著升高，并且PC-9细胞中的ICAM-1蛋白表达上调。通过添加外源性重组CCL2蛋白，可以模拟共培养的效果，增强耐药性；而使用CCL2特异性抑制剂bindarit或敲低ICAM-1的表达，则能逆转这种耐药表型。
CCL2/ICAM-1在奥希替尼耐药NSCLC患者的MPE中表达
临床样本分析进一步支持了上述发现。ELISA检测显示，耐药患者恶性胸腔积液中的CCL2水平显著高于敏感患者。多重免疫组化结果直观表明，在耐药患者的恶性胸腔积液样本中，Macro_FOLR2巨噬细胞的密度以及CCL2和ICAM-1的蛋白表达均明显上调。
研究结论与意义
本研究通过高分辨率的单细胞测序技术，系统描绘了EGFR突变型非小细胞肺癌患者对奥希替尼耐药后，其恶性胸腔积液这一特殊肿瘤微环境中发生的深刻变化。研究不仅鉴定出一个与不良预后相关的、具有干细胞特性的恶性上皮细胞亚群（Malignant_HSPA6），还发现了一个在耐药环境中富集的M2样巨噬细胞亚群（Macro_FOLR2）。最关键的是，研究揭示了这两个细胞群体之间存在一条以前未知的促耐药“对话”通路：Macro_FOLR2巨噬细胞通过分泌CCL2，作用于Malignant_HSPA6肿瘤细胞，上调其ICAM-1的表达，进而共同增强肿瘤的干细胞特性、迁移增殖能力，并最终导致对奥希替尼的耐药。
这一发现具有多重重要意义。首先，它从肿瘤微环境中细胞互作的新视角，阐明了EGFR-TKI耐药的一种全新机制，丰富了我们对耐药异质性的理解。其次，研究将CCL2/ICAM-1轴锁定为连接免疫细胞（巨噬细胞）与肿瘤细胞（上皮细胞）功能的关键枢纽，为逆转耐药提供了潜在的治疗靶点。例如，使用CCL2抑制剂（如bindarit）或靶向ICAM-1的策略，有望与现有的EGFR-TKI药物联合使用，以克服或延缓耐药的发生。最后，该研究再次凸显了恶性胸腔积液作为反映体内真实肿瘤微环境“窗口”的重要价值，以及单细胞测序技术在解析复杂生物过程、发现新机制方面的强大能力。尽管未来仍需在更大规模的队列和动物模型中进行验证，但这项研究无疑为攻克非小细胞肺癌的靶向治疗耐药难题，开辟了一条充满希望的新路径。
