《ACS Chemical Neuroscience》：Fluorescence Detection of Alpha-Synuclein Aggregates in the Gut Using a Peptide Probe
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本项研究开发了一种基于PSMα3肽序列的荧光成像探针P1，能够特异性标记帕金森病(PD)相关的病理α-突触核蛋白(α-syn)聚集体。该探针在细胞、PFF注射小鼠及转基因小鼠的胃肠道(GI)组织中，展现出与磷酸化α-syn抗体(pS129)相当的标记准确性与特异性(PPV达87%)，并能有效检测结肠黏膜表层的α-syn聚集体。P1具备成本低、染色快、特异性高等优势，为通过内镜活检或筛查对PD风险进行早期分子诊断提供了有前景的新工具。
BODIPY630/650 作为优化的标记荧光团
研究团队旨在开发一种能够特异性标记病理α-突触核蛋白(α-syn)聚集体的肽基荧光探针。基于先前报道的阳离子α-螺旋肽PSMα3对α-syn寡聚体和淀粉样纤维具有高亲和力的特性，研究人员首先尝试使用中性电荷、低分子量、高量子产率的BODIPY-FL荧光团标记肽段，得到探针P0。然而，BODIPY-FL的绿色荧光通道易受组织自发荧光干扰，导致高背景。为避免此问题，研究转向使用更长激发/发射波长的远红外染料。在尝试了多种染料后，最终确定BODIPY630/650为最合适的荧光团，其背景信号低，游离染料在细胞中无染色，由此合成的BODIPY630/650标记肽被命名为探针P1。P1的合成快速、单步、高产率(90%)，便于放大生产，且其荧光和理化性质可通过修饰BODIPY基团进一步优化。
P1在原代海马神经元中对α-syn聚集体展现高标记特异性
为验证探针特异性，研究在体外模型中使用了从新生小鼠制备的原代海马神经元，以模拟神经元环境。通过向神经元添加α-syn预制纤维(PFFs)诱导内源性α-syn形成路易体样聚集体。结果发现，在未添加PFFs的对照细胞中，P1不标记α-syn单体；而在添加PFFs的细胞中，P1能够特异性标记聚集的α-syn，并与作为金标准的磷酸化丝氨酸129 α-syn抗体(pS129)染色具有良好的共定位。经计算，P1的阳性预测值(PPV)平均为87.4%，漏检率仅为8.7%，表明其对α-syn聚集体具有高特异性。
P1优先结合B*寡聚体和纤维，而非A*寡聚体和单体
为深入了解P1的标记性质，研究分析了其与不同α-syn物种（非毒性A*寡聚体、毒性B*寡聚体、PFFs和单体）的结合特性。光谱测量显示，P1与B*寡聚体和PFFs结合时，其荧光激发和发射峰强度显著增强，这可能是由于肽段结合到β-折叠疏水区域，限制了荧光团旋转并屏蔽了水分子的非辐射猝灭所致。荧光滴定实验测得P1与PFFs的结合解离常数(KD)为1.4 ± 0.26 μM。天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和斑点印迹(Dot blot)结果均证实，P1能够特异性地与毒性B*寡聚体和PFFs结合，而不与单体或非毒性A*寡聚体结合，且对人类和小鼠来源的α-syn聚集体均有效。
P1在PFF注射小鼠组织和PD患者死后脑组织中检测α-syn聚集体，背景信号低
研究在PFF注射的野生型小鼠模型中评估了P1的离体组织染色效果。在脑内注射PFFs的小鼠海马和皮层区域，观察到了高水平的α-syn聚集，P1与pS129抗体均能特异性标记。相比之下，绿色荧光探针P0因与组织自发荧光重叠而难以区分，凸显了使用远红外染料的重要性。在肠道注射PFFs的小鼠十二指肠组织中，仅观察到低水平的α-syn聚集，这可能是由于所用小鼠相对年轻(4-6月龄)，α-syn病理成熟具有年龄依赖性。此外，在PD患者死后黑质脑组织切片中，P1能够标记路易体(LB)和路易神经突(LN)，染色模式与pS129抗体相似，表明其对临床样本中的α-syn聚集体同样具有高特异性。
P1在转基因小鼠胃肠道中高亮α-syn聚集体的差异积累
为评估α-syn聚集在胃肠道组织内的分布，研究采用了两种过表达α-syn的转基因PD小鼠模型(JAX004479和JAX010799)。通过对食管、胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠组织的全面分析，发现α-syn聚集在整个胃肠道均有分布，其中在食管和结肠中的染色强度最高。P1的染色与pS129抗体染色高度共定位(平均91.0%)，且在各组织中的阳性预测值(PPV)保持一致(平均87.8%)，证明其标记特异性不受不同胃肠道组织环境影响。高倍镜下，在结肠组织的肠神经元中也能观察到P1的标记。
α-syn聚集随转基因小鼠年龄增长而增加
比较年轻(5月龄)和年老(15月龄)的JAX010799转基因小鼠发现，年老小鼠脑部和胃肠道组织中总α-syn水平以及高分子量α-syn物种均增加。免疫组化染色和图像分析也一致显示，年老小鼠食管和结肠组织中α-syn聚集的丰度更高。通过比较P1染色与总α-syn抗体染色的比值，以及pS129抗体与总α-syn抗体的比值，发现在所有胃肠道组织中，年老小鼠的α-syn聚集程度均更高，且两种标记方法趋势一致，表明肽探针P1作为诊断标志物的潜力可与pS129抗体相媲美。
α-syn聚集体在结肠黏膜中可被检测
由于内镜成像主要限于黏膜层，研究评估了结肠黏膜中α-syn聚集的丰度，以探讨内镜检测的可行性。在转基因小鼠展开的结肠组织中，α-syn聚集体在黏膜、黏膜下层和肌层均有分布，其中肌层聚集程度最高，但仍有超过20%的黏膜层α-syn被标记为聚集形式。这表明α-syn聚集是潜在的、可通过胃肠道进行PD筛查的生物标志物。为模拟临床结肠镜检查中喷洒对比剂的过程，研究将P1快速灌洗到新鲜转基因小鼠结肠的管腔内。结果显示，P1能特异性标记深度约30 μm的表层黏膜中的α-syn聚集体，并与抗体染色共定位。这证明了P1在镜检应用中用于表层染色的实用性，但其穿透深度有限，能否成功应用于体内结肠镜检查，将很大程度上取决于表层黏膜是否存在足够量的α-syn聚集体。
综上所述，这项研究开发了一种肽基荧光探针P1，能够在多种细胞和动物模型中特异性标记α-syn聚集体，其性能与磷酸化α-syn抗体相当。P1具有成本低、染色快速、特异性高等优势，展现了作为诊断工具用于胃肠道组织活检或常规内镜筛查以评估帕金森病风险的前景。通过进一步的临床验证，P1有望为老年人群的帕金森病监测及患者分期提供新手段。
