人源化MISTRG6小鼠：研究急性闭合性腹腔感染（CLP）败血症早期骨髓变化的相关转化模型

《Shock》：Humanized MISTRG6 Mice: A Relevant Translational Model for Examining Early Bone Marrow Changes in Acute CLP Sepsis

人类化MISTRG6小鼠模型成功模拟CLP脓毒症早期骨髓重塑，表现为造血干细胞动态变化及微环境组成改变，为研究人类造血和脓毒症治疗提供新工具。

　　

简而言之

人源化的MISTRG6小鼠模型揭示了脓毒性休克（CLP）早期骨髓重塑的情况，包括造血干细胞（HSPC）动态和微环境的改变。该模型对于研究人类造血过程及CLP后的治疗干预措施具有很高的转化应用价值。

动物模型在推进我们对脓毒症病理生理学的理解方面发挥了不可或缺的作用。然而，不同物种在免疫系统结构和功能上的固有差异可能会限制小鼠模型的转化应用性（¹）。尽管这些差异并不妨碍小鼠模型在脓毒症研究中的实用性，但它们使得将研究结果外推到人类疾病时变得复杂，从而减弱了临床前研究的转化意义（²）。在骨髓重塑和脓毒后免疫抑制的背景下，这一问题尤为突出；小鼠脓毒症模型无法完全反映人类免疫反应的复杂性和时间动态。人源化小鼠模型的发展，尤其是那些能够支持功能性先天性和适应性细胞的小鼠模型，在很大程度上克服了这一转化障碍。其中，MISTRG6小鼠模型在Rag2^?/^? IL2Rγ^?/^?背景下敲入了对造血至关重要的关键人类细胞因子（如M-CSF、GM-CSF/IL-3、TPO、IL-6和SIRPα），为准确再现人类情况提供了有力平台。Rongvaux等人证明了这一点，他们发现MISTRG6小鼠能够产生CD16⁺单核细胞和功能性NK细胞，而这些在其他人源化小鼠模型中并未观察到（³）。此外，最近的研究还展示了该模型在SARS-CoV-2相关研究中的应用（⁴）。本研究首次评估了MISTRG6小鼠在结肠结扎和穿刺（CLP）模型中的表现，以及其在研究人类造血早期变化方面的实用性。

为了生成人源化MISTRG6（huMISTRG6）小鼠，研究人员将2至4天大的小鼠接受了5×10⁴个来自脐带血的纯化人类CD34⁺造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的移植（图1A）。移植前未对小鼠进行辐照处理，因为这种处理会加剧供体来源的巨噬细胞对红细胞的吞噬作用，导致贫血，而先前的研究也表明缺乏辐照并不会影响hCD34⁺细胞的骨髓植入或分化（^{3）。注射6周后收集外周血，使用抗人类CD45抗体进行流式细胞术分析，确认人类细胞成功植入，平均嵌合率为20%（n=44；SD=21.23；图1B）。这一人源化程度在所有三个实验组中都是一致的（Kruskal-Wallis检验；P=0.1603；数据未显示）。根据我们之前的研究（5），为了进一步研究CLP及成熟免疫细胞的详细免疫表型，我们选择了循环系统中hCD45+细胞占比≥5%的小鼠，因为这一阈值能确保宿主小鼠充分人源化。}

图1：

脓毒症诱导后人源化MISTRG6小鼠的早期造血和微环境重塑。 A. 实验工作流程示意图：从脐带血中分离出人类CD34⁺ HSPCs并移植到2-4天大的MISTRG6小鼠体内。6周后，通过外周血评估人源化程度，并对小鼠进行CLP处理以诱导多微生物脓毒症。CLP后24小时采集骨髓细胞，通过多色流式细胞术进行分析。B. 以外周血中人类CD45⁺细胞的比例表示huMISTRG6小鼠的人源化效率。C. Kaplan-Meier生存曲线显示，与对照组相比，huMISTRG6小鼠的存活率显著降低。D. CLP组和对照组小鼠的体重变化，CLP组持续出现体重下降。E. CLP后SUR组和DIED组之间的体温有显著差异，死亡小鼠表现出体温过低（*P<0.05）。F和G. CLP后24小时，huMISTRG6组和对照组小鼠的骨髓细胞总数及hCD45⁺细胞数量。H和I. 骨髓中人类原始HSCs（CD34⁺CD38^?）的绝对数量和比例，显示CLP组中hCD45⁺细胞数量增加但比例下降。J和K. 骨髓中CD169⁺人类巨噬细胞的绝对数量和频率，显示CLP后比例下降但绝对数量增加。L. 代表性流式细胞术图表，显示了对照组和CLP组骨髓CD34⁺CD38^?细胞的分选策略。DIED表示死亡的小鼠；HSPC表示造血干细胞/祖细胞；SUR表示存活的小鼠。

脓毒症是通过标准化协议（^{6）的CLP诱导的，该协议旨在产生可重复的全身炎症和中度早期死亡率。我们自定义调整的人源化CLP模型产生了临床上相关的43%死亡率（7），并在监测的7天期间逐渐分布（图1C）。脓毒症huMISTRG6小鼠表现出典型的CLP后体重下降（图1D）和体温下降，这与预期的代谢恶化和早期腹部脓毒症症状一致。此外，根据CLP结果的不同，体温也表现出明显差异（图1E），体温下降准确预测了早期死亡率（曲线下面积：0.79），这与非人源化小鼠CLP模型一致（8）。上述数据表明huMISTRG6小鼠可以有效地用于CLP脓毒症模型。}

接下来，我们在CLP后24小时处死了另一组huMISTRG6小鼠，并分析了骨髓中人类HSPCs的数量，重点关注两个不同的细胞群体：i) 原始人类HSCs（CD34⁺CD38^?）和ii) 更成熟的祖细胞（CD34⁺CD38⁺）。处死后立即采集股骨并进行多色流式细胞术分析。原始人类HSCs被定义为hCD45⁺Lin^?CD34⁺CD38^?细胞，而祖细胞被定义为hCD45⁺Lin^?CD34⁺CD38⁺，这与人类干细胞和祖细胞的典型免疫表型一致（图1K）。所有数据均使用CytoFLEX SRT II（Beckman Coulter）仪器收集，并通过FlowJo v10（BD Biosciences）软件进行分析。

流式细胞术分析显示，CLP诱导下总体细胞数量（对照组：2.83×10⁴ vs. CLP组：2.15×10⁵细胞）和hCD45⁺细胞数量（对照组：4.16×10³ vs. CLP组：4.55×10⁴细胞）显著增加（图1，F和G）。我们还观察到hCD45⁺细胞群体中CD34⁺CD38^?细胞的比例下降了68%，同时hCD45⁺细胞的总数增加了（对照组：4.8×10² vs. CLP组：1.7×10³细胞）（图1，H和I）。这些结果表明，在CLP脓毒症的早期阶段，骨髓细胞数量迅速且显著增加。hCD45⁺细胞数量的增加可能是HSPC分化的标志。然而，我们未观察到CD34⁺CD38⁺祖细胞的数量和比例发生变化（数据未显示）。

我们的数据表明，在CLP脓毒症的早期阶段，CD34⁺CD38^?细胞的自我更新和分化能力得到增强。这反过来又促进了这一细胞群体的扩增，同时保持了CD34⁺CD38⁺祖细胞的数量，这些祖细胞可能部分分化为hCD45⁺细胞。Skirecki等人的研究也观察到了类似的早期反应（^{9）。在他们的人源化脓毒症模型（移植了CD34+细胞并接受CLP处理的NSG小鼠）中，他们发现骨髓中CD34+CD38?细胞的数量增加，而CD34+CD38+祖细胞的数量保持不变。此外，CLP后所有CD34+细胞的增殖活性也增加。}

我们的研究与Skirecki等人的研究也存在一些差异。虽然我们观察到骨髓细胞数量增加，但他们的hu-NSG小鼠模型显示细胞数量减少，这可能是由于细胞迁移到外周血液所致。这些差异可能由多种因素引起，包括小鼠品系（NSG vs. MISTRG6）、脓毒症严重程度、人源化效率等方面的差异。据我们所知，目前没有科学出版物能够直接将我们的发现与患者的临床结果进行比较，因为骨髓活检存在明显的技术和伦理限制。

造血干细胞的生理活性取决于其微环境。因此，我们研究了脓毒症对人类骨髓巨噬细胞（定义为hCD45⁺CD11b⁺CD33⁺CD14^?CD169⁺（CD169⁺ Mφ）的影响。这种细胞群体在人类和小鼠中都存在，被认为通过为红细胞生成提供铁质并阻止HSPCs从骨髓迁移到外周血液中来支持造血（¹⁰）。在我们的huMISTRG6 CLP小鼠中，我们观察到CD169⁺ Mφ的频率显著降低了36%，但其绝对数量没有变化（对照组：3.5×10² vs. CLP组：1.4×10³细胞）（图1，J和K）。这种差异可能反映了骨髓中hCD45⁺细胞数量的总体增加。然而，CLP后24小时CD169⁺ Mφ和CD34⁺CD38^?细胞的绝对数量增加既不支持也不完全反驳巨噬细胞促进HSPCs在骨髓中增殖和保留的假设。我们的发现表明，腹部脓毒症不仅改变了CD34⁺CD38^?细胞，还改变了构成其微环境的CD169⁺ Mφ群体。

基于使用huMISTRG6小鼠进行的脓毒症模型研究，我们发现在CLP后24小时就已经发生了显著的骨髓变化。这些变化反映了造血的激活和微环境的变化。CD45⁺细胞数量的增加可能是HSPCs分化的结果。同时，我们观察到CD34⁺CD38^?细胞的绝对数量增加，尽管其在CD45⁺细胞群体中的比例下降，这表明这些细胞可能被激活并具有自我更新能力。CD45⁺群体中CD169⁺巨噬细胞比例的下降（尽管其绝对数量增加）表明骨髓微环境细胞群体的组成发生了变化。

这些发现强调了人源化MISTRG6模型在研究CLP脓毒症后早期骨髓变化方面的转化价值。虽然我们的初步数据仅限于CLP后24小时，但huMISTRG6平台能够进行至少长达7天的纵向分析，以研究造血恢复、谱系偏移和免疫重建情况。此外，huMISTRG6小鼠为测试旨在减轻微环境损伤、调节细胞因子反应和支持干细胞功能的治疗策略提供了机会。

由于这项研究的初步性质，它存在一些局限性。首先，样本量（特别是用于相关性分析的样本量）有限，降低了检测潜在有意义关联的统计能力。其次，研究仅限于CLP后的一个早期时间点（24小时），未能捕捉到早期脓毒症期间骨髓重塑和免疫抑制的完整时间动态。第三，尽管huMISTRG6小鼠能够再现人类造血的关键方面，但它们是在小鼠的生理环境中进行的，这可能会影响免疫反应，从而与人类患者的免疫反应有所不同。最后，我们的分析主要关注通过流式细胞术评估的表型变化，而没有直接评估功能结果，如HSPCs的克隆能力、分化能力和向外周血液的迁移。例如，Unsinger等人之前已经报道过CLP后人源化NSG小鼠中淋巴细胞凋亡增加的情况（^{11）。未来的研究将通过更大的样本量、纵向随访和补充的功能性检测来弥补这些局限性，以全面阐明人类脓毒症中造血微环境破坏的机制。}

总之，这项研究首次将CLP脓毒症模型与人源化MISTRG6小鼠平台相结合，证明了其在模拟临床相关的全身炎症和早期死亡率方面的有效性。我们的发现验证了huMISTRG6模型作为研究脓毒症诱导的骨髓造血动态和微环境重塑的强大工具，而这些在脓毒症患者中通常是无法获得的。