《Cancer Immunology, Immunotherapy》：CAR T cells derived from a novel, high-affinity anti-CLL-1 monoclonal antibody exhibit a significant anti-AML effect
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为解决CLL-1low/?急性髓系白血病（AML）细胞对现有CAR-T疗法不敏感的问题，研究人员研发了源自新型高亲和力抗CLL-1单抗2-23的CAR-T细胞。该细胞在体外和体内均展现出优异的细胞因子分泌、细胞毒性和抗白血病效果，并能与menin抑制剂revumenib联用，诱导CLL-1低表达AML细胞对CAR-T疗法增敏，为AML治疗提供了新策略。
在急性髓系白血病（AML）的治疗战场上，尽管嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤中取得了革命性成功，但对于AML，这一疗法却迟迟未能获得批准，成为临床上一个亟待攻克的堡垒。AML的“狡猾”之处在于其高度的异质性和复发率，尤其是那些对化疗耐药的难治性患者，亟需新的治疗武器。在众多被探索的治疗靶点中，C型凝集素样分子-1（CLL-1）因其在AML细胞（包括白血病干细胞）上高表达，却在正常造血干细胞上几乎不表达的特性，成为了一个极具吸引力的“理想靶标”。
然而，理想与现实之间总有差距。临床观察发现，部分AML患者的白血病细胞呈现CLL-1低表达（CLL-1low）甚至不表达（CLL-1?），现有的基于M26单抗的CLL-1 CAR-T细胞对这些“隐身”的AML克隆杀伤力有限。这就像一把钥匙无法完全打开所有锁，意味着单靠现有疗法可能无法根除所有白血病细胞，导致疾病复发。那么，能否打造一把“万能钥匙”——即研发具有更高敏感性的CAR-T细胞，或者找到方法让“隐身”的细胞重新“现身”以便被精准清除呢？这正是发表于《Cancer Immunology, Immunotherapy》上的这项研究试图回答的核心问题。
为了解决上述挑战，研究人员开展了一系列系统性的探索。首先，他们致力于“升级”CAR-T细胞的“瞄准镜”。通过用表达人CLL-1的细胞免疫小鼠，他们筛选出了13株全新的抗CLL-1单克隆抗体，并以此为基础构建了相应的CAR-T细胞。经过层层筛选，源自单抗2-23的CAR-T细胞（2-23 CAR-T）脱颖而出，其在与AML细胞共培养时，展现出了最强的白细胞介素-2（IL-2）分泌能力。进一步分析显示，2-23单抗对CLL-1的亲和力显著高于先前临床研究中常用的M26单抗，这使得2-23 CAR-T细胞能够更敏感地识别并攻击CLL-1表达水平很低的AML细胞，在体外实验中，其对CLL-1低表达细胞的反应强度超过了M26 CAR-T细胞。
拥有了更强的“武器”，接下来要验证其“实战”效果。研究人员构建了AML异种移植小鼠模型，将表达荧光素酶的白血病细胞注入免疫缺陷小鼠体内，模拟人类AML的疾病进展。令人振奋的是，一次输注2-23 CAR-T细胞就能近乎彻底清除小鼠体内的白血病细胞，并显著延长了小鼠的生存期，而接受对照T细胞治疗的小鼠则很快因白血病进展而死亡。这强有力地证明了2-23 CAR-T细胞在体内的强大抗白血病活性。
然而，研究者的思考并未止步。对于那些初始就完全不表达CLL-1的AML患者，即便“瞄准镜”再灵敏也无济于事。于是，研究的第二部分转向了“让靶点现身”的策略。他们筛选了包括revumenib（一种menin抑制剂）、阿扎胞苷、地西他滨在内的几种临床常用AML治疗药物，观察它们能否诱导AML细胞表达CLL-1。结果发现，revumenib处理能显著上调携带MLL融合基因或NPM1突变的AML细胞系（如MOLM13、THP-1、OCI-AML3）表面的CLL-1表达。更重要的是，这种“诱导现身”具有功能意义：经过revumenib预处理后，原本对2-23 CAR-T细胞不敏感的MOLM13细胞，变得能够有效激活CAR-T细胞并产生大量干扰素-γ（IFN-γ）和IL-2，同时也更容易被CAR-T细胞杀伤。这为联合用药策略奠定了坚实的实验基础。
本研究的关键技术方法主要包括：
- 1.
新型单克隆抗体开发与筛选：通过小鼠免疫、杂交瘤技术生成新型抗CLL-1单克隆抗体库，并利用流式细胞术筛选特异性抗体。
- 2.
CAR-T细胞构建与功能评估：克隆抗体可变区序列，构建基于CD28-CD3ζ共刺激结构的第二代CAR，通过逆转录病毒转导制备CAR-T细胞，并通过细胞因子释放实验、51Cr释放实验和荧光素酶报告实验系统评估其体外激活、增殖和杀伤功能。
- 3.
基因修饰细胞系构建：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建CLL-1敲除（KO）的U937细胞，以及利用短发夹RNA（shRNA）慢病毒感染构建CLL-1敲低（KD）的U937细胞亚克隆，用于模拟不同CLL-1表达水平的AML并验证CAR-T细胞的敏感性。
- 4.
体内疗效评估：建立基于免疫缺陷NOG小鼠的AML异种移植模型，尾静脉注射荧光素酶标记的AML细胞系（U937）模拟播散性疾病，通过活体成像技术监测白血病负荷，评估CAR-T细胞的体内抗肿瘤效果和动物生存期。
- 5.
药物处理与表型分析：用不同浓度的小分子抑制剂（如revumenib）或去甲基化药物处理AML细胞系，通过流式细胞术分析药物对CLL-1及其他细胞表面抗原表达的影响，并评估药物预处理对CAR-T细胞功能的影响。
研究结果
CAR T cells derived from a new anti-CLL-1 mAb 2–23 were identified as having high potential to produce cytokines when co-cultured with AML cells
研究人员成功筛选出13株新的抗CLL-1单抗，并构建了相应的CAR-T细胞。其中，源自单抗2-23的CAR-T细胞在与AML细胞共培养时，表现出最强的IL-2分泌潜能。该CAR-T细胞能特异性识别CLL-1阳性细胞（如U937、HL-60），并产生IFN-γ和IL-2以及发挥细胞毒性，而对CLL-1敲除的细胞则无反应。
CAR T cells derived from the 2–23 mAb are more sensitive than those derived from the preexisting anti-CLL-1 mAb, M26
结合动力学分析表明，2-23单抗对CLL-1的亲和力高于先前研究中使用的M26单抗。在针对一系列通过shRNA技术构建的、表达不同水平CLL-1的U937细胞亚克隆的实验中，2-23 CAR-T细胞在共培养时产生的IFN-γ和IL-2量均高于M26 CAR-T细胞。特别值得注意的是，对于CLL-1表达极低的细胞克隆，2-23 CAR-T细胞仍能检测到IL-2分泌，而M26 CAR-T细胞则不能。尽管两者对低表达克隆都表现出细胞毒性，但2-23 CAR-T细胞显示出更高的敏感性。
Treatment with 2–23 CAR T cells eradicated AML cells in an in vivo xenograft model
在AML异种移植模型中，输注2-23 CAR-T细胞能有效清除小鼠体内的白血病细胞，生物发光成像显示肿瘤信号显著减弱甚至消失，并显著延长了荷瘤小鼠的生存期。相反，所有接受对照T细胞治疗的小鼠均在短期内死于白血病进展。这证实了2-23 CAR-T细胞在体内的强大疗效。
Treatment with the menin inhibitor revumenib increases CLL-1 expression in AML cells with the MLL fusion genes or the NPM1 mutation and sensitizes them to cytotoxicity by 2–23 CAR T cells in vitro
研究发现，menin抑制剂revumenib能特异性诱导携带MLL融合基因（MOLM13, THP-1）或NPM1突变（OCI-AML3）的AML细胞系表达CLL-1，而阿扎胞苷和地西他滨的诱导效果不明显或微弱。功能实验证实，经revumenib预处理后，原本CLL-1低表达的MOLM13细胞能更有效地激活2-23 CAR-T细胞，导致IFN-γ和IL-2分泌量显著增加，同时也变得更容易被CAR-T细胞杀伤。
研究结论与意义
本研究成功鉴定并开发了源自新型高亲和力抗CLL-1单克隆抗体2-23的CAR-T细胞。该细胞相较于基于传统M26单抗的CAR-T细胞，对CLL-1抗原具有更高的亲和力和敏感性，能够更有效地识别和杀伤CLL-1低表达的AML细胞，并在AML异种移植模型中展现出强大的体内抗白血病活性，能够清除肿瘤并显著延长生存期。这为克服因靶点表达异质性导致的治疗抵抗提供了新的解决方案，预示着2-23 CAR-T细胞有望成为针对CLL-1阳性AML患者更具潜力的治疗选择，尤其适用于作为异基因造血干细胞移植（allo-HCT）前的桥接治疗。
此外，本研究具有重要的策略拓展意义。研究者创新性地提出并初步验证了“药物诱导靶点+CAR-T精准清除”的联合治疗思路。他们发现，menin抑制剂revumenib可以上调特定基因分型（MLL重排或NPM1突变）AML细胞表面的CLL-1表达，从而使这些原本可能逃逸CLL-1 CAR-T疗法的细胞变得敏感。这为解决CLL-1阴性或极低表达AML患者的治疗难题提供了新方向。虽然这种联合策略可能因同时影响正常髓系细胞而带来脱靶毒性风险，需要谨慎评估，但它无疑拓宽了CLL-1靶向疗法的应用边界。
综上所述，这项研究不仅贡献了一个具有高临床转化潜力的新型CLL-1 CAR-T候选产品（2-23 CAR-T），还提出了一种有望克服靶点丢失/低表达这一常见耐药机制的联合治疗新范式。研究成果支持推进2-23 CAR-T细胞进入临床试验，并鼓励未来探索其与revumenib等药物联用以治疗更广泛AML患者的可能性，为最终攻克急性髓系白血病这一难题增添了重要的砝码。
