罗伊氏乳杆菌DSM 17938通过调控T细胞-巨噬细胞对话缓解自身免疫性肝损伤的机制研究

《Frontiers in Immunology》：Limosilactobacillus reuteri alleviates proinflammatory T-cell-mediated liver injury and transcriptomic changes in immunocompromised mice

本综述聚焦益生菌调节免疫细胞通讯在自身免疫性肝病（AILD）中的作用。研究表明，源自缺乏调节性T细胞（Treg）的Scurfy（SF）小鼠的炎症性CD4+T细胞，在移植至免疫缺陷（RAG1KO）小鼠后，可诱发肝炎、巨噬细胞（MΦ）浸润及肝脏促炎与代谢基因谱异常。而口服益生菌罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）DSM 17938预处理后，所获得的CD4+T细胞能显著减轻上述病理变化，逆转炎症相关基因（如Toll样受体/TLR通路、脂质运载蛋白-2/Lcn2）的上调及代谢与解毒基因的下调，并影响选择性剪接事件与肠道菌群。这提示益生菌“教育”的T细胞可通过调节T细胞-巨噬细胞-肠道微生物轴的复杂互作，为AILD提供新的治疗思路。

　　

1. 引言

免疫系统由先天和适应性组分构成，以保护机体免受病原体侵害。适应性免疫系统的稳态依赖于具有免疫抑制特性的调节性T细胞（Tregs）。Treg功能缺失，如见于Scurfy（SF）小鼠或人类IPEX综合征，可导致多器官炎症。当前，自身免疫性肝炎（AIH）等自身免疫性肝病（AILD）的治疗主要依赖于皮质类固醇等免疫抑制剂，部分患者仍会进展至肝衰竭。益生菌可通过在肠道内“教育”T细胞，促进Treg并抑制Th1/Th2/Th17等炎症性T细胞，产生全身性抗炎效应。口服益生菌罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）DSM 17938可重塑SF小鼠的微生物组，并改善其Th1/Th2相关炎症。本研究旨在利用缺乏成熟B、T淋巴细胞的RAG-1缺陷（RAG1KO）小鼠模型，探讨经益生菌调教的CD4⁺T细胞对肝脏巨噬细胞（MΦ）的影响及其在肝病中的病理生物学机制。

2. 材料与方法

研究使用野生型（WT）、SF小鼠及RAG1KO小鼠。SF小鼠自出生第8天至第20天，每日灌胃给予DSM 17938（10⁷CFU）或无菌生理盐水。第21天，从小鼠脾脏分离CD4⁺T细胞，分别定义为益生菌调节的SF-CD4⁺T细胞（Prob-SF-CD4⁺T）和对照SF-CD4⁺T细胞（SF-CD4⁺T）。将1×10⁶个活细胞通过腹腔注射过继转移（AT）至10周龄RAG1KO小鼠体内，分别命名为RAG1KOATSFL组和RAG1KOATSFC组。以未接受T细胞移植的RAG1KO小鼠（RAG1KOnoAT）作为对照。移植4周后，收集小鼠肝脏组织进行组织学评估、巨噬细胞（F4/80⁺）免疫组化染色、RNA测序（RNAseq）转录组分析，并收集粪便进行16S rRNA测序分析肠道微生物群。通过流式细胞术分析了SF小鼠脾脏CD4⁺T细胞的活化标志物（CD62L, CD25）。

3. 结果

3.1 过继转移Prob-SF-CD4⁺T细胞改善了免疫缺陷RAG1KO小鼠的肝脏炎症

流式分析显示，SF小鼠脾脏中CD4⁺T细胞的比例和绝对数量均显著增加，且活化标志物CD62L表达降低、CD25表达升高，表明其处于活化状态。口服DSM 17938可逆转这些变化。组织学评估表明，过继转移SF-CD4⁺T细胞（RAG1KOATSFC）可导致RAG1KO小鼠发生肝炎，表现为多灶性门脉周围淋巴细胞浸润和变性肝细胞，炎症发生率为100%。相比之下，过继转移Prob-SF-CD4⁺T细胞（RAG1KOATSFL）的小鼠，肝炎发生率降至60%，且炎症严重程度（Batts-Ludwig评分）显著降低。

3.2 Prob-SF-CD4⁺T细胞减少了由炎症性SF-CD4⁺T细胞增强的肝脏巨噬细胞浸润

免疫组化显示，与RAG1KOnoAT或WT小鼠相比，RAG1KOATSFC小鼠肝脏中F4/80⁺MΦ数量显著增加。而过继转移Prob-SF-CD4⁺T细胞则部分但显著地减少了MΦ的浸润。肝脏转录组分析进一步揭示了36个与MΦ极化相关的基因，这些基因在SF-CD4⁺T细胞移植后上调，而在Prob-SF-CD4⁺T细胞移植后下调。这些基因涉及M1和M2表型，并与脂质、铁、氨基酸等代谢过程相关。

3.3 转移SF-CD4⁺T细胞改变了RAG1KO小鼠的肝脏基因谱

差异表达基因（DEG）分析表明，SF-CD4⁺T细胞移植广泛影响了肝脏的炎症和代谢通路。

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  上调炎症通路：包括Toll样受体（TLR）级联反应、细胞因子信号（如TNF、IL-17、GM-CSF）、中性粒细胞脱颗粒、GTP酶循环、活性氧/氮物种产生，以及Fcγ受体、抗原提呈、T细胞受体（TCR）信号和死亡受体信号等相关基因。
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  下调线粒体功能与呼吸链复合物：许多与线粒体生物发生、核糖体蛋白（RPL/RPS）、线粒体核糖体蛋白（MRP）及线粒体呼吸链（MRC）复合物I-V（如Nduf, Uqcr, Cox, Atp5家族）相关的基因表达下调，提示能量代谢和氧化磷酸化受损。
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  下调肝脏解毒基因：包括参与活性氧解毒的谷胱甘肽S-转移酶Pi（Gstp1/2）、过氧化物氧还蛋白5（Prdx5），参与生物氧化的细胞色素P450（Cyp）家族，以及负责葡萄糖醛酸化的UDP葡萄糖醛酸基转移酶2b（Ugt2b38）等基因表达降低。
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  下调营养代谢基因：涉及氨基酸（如色氨酸犬尿氨酸通路）、三羧酸（TCA）循环、脂肪酸氧化与合成（如Fabp, Acaa1b, Ehhadh）以及葡萄糖代谢的基因表达普遍下调。主要尿蛋白（Mup）基因家族也显著下调。

3.4 Prob-SF-CD4⁺T细胞逆转了SF-CD4⁺T细胞诱导的许多肝脏基因变化

与SF-CD4⁺T细胞相比，Prob-SF-CD4⁺T细胞移植产生了相反的基因表达模式：

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  下调炎症基因：包括TLR级联、IL-1信号、MAPK激活和NF-κB信号通路中的特定组分，如Clec7a（Dectin-1）、Ctsc、Lcn2等。特别值得注意的是，Prob-SF-CD4⁺T细胞下调了五个独特的NF-κB调节基因：Cul1、Fbxw11、Ubc、Tank和Ppp2ca。
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  上调代谢与细胞周期基因：部分逆转了SF-CD4⁺T细胞引起的代谢抑制，上调了少量与TCA循环（如Suclg1, Idh3b）、MRC电子传递/ATP合成（如Ndufc1, Uqcr10, Atp5g3）相关的基因。此外，还上调了与细胞周期（G1-S-G2-M期）调控相关的基因。
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  基因互作网络：受影响的基因形成两个相互作用的集群，一个与炎症通路相关（多被SF-CD4⁺T细胞上调/被Prob-SF-CD4⁺T细胞下调），另一个与代谢通路相关（多被SF-CD4⁺T细胞下调/被Prob-SF-CD4⁺T细胞上调）。这两个集群主要通过血红素氧合酶-1（Hmox1）和铁氧还蛋白1（Fdx1）基因连接，提示铁代谢与炎症之间存在潜在联系。

3.5 过继转移SF小鼠的CD4⁺T细胞影响RAG1KO小鼠肝脏的RNA多样性

SF-CD4⁺T细胞移植改变了多种剪接因子（SFs）的表达，并影响了外显子跳跃（SE）、内含子保留（RI）、互斥外显子（MXE）等多种RNA选择性剪接事件的数量。而Prob-SF-CD4⁺T细胞移植则减少了这些剪接事件。其中，三个发生剪接的基因——干扰素调节因子7（Irf7）、白介素-1受体相关激酶1（Irak1）和Map3k7（TAK1）——是TLR/先天免疫网络的一部分，其剪接变体可能负向调节炎症。

3.6 过继转移SF小鼠的CD4⁺T细胞改变了RAG1KO小鼠的肠道微生物群

微生物群分析显示，接受CD4⁺T细胞移植（无论是SF-CD4⁺T还是Prob-SF-CD4⁺T）的RAG1KO小鼠，其肠道菌群结构与未接受移植的RAG1KOnoAT小鼠显著不同。在门水平上，移植后厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度降低，拟杆菌门（Bacteroidota）升高。在属水平上，Anaeroplasma丰度降低，Alistipes丰度增加。值得注意的是，虽然Prob-SF-CD4⁺T细胞移植对微生物群整体多样性的影响与SF-CD4⁺T细胞相似，但它特异性地增加了Incertae_sedis的相对丰度，降低了Clostridia_vadinBB60_group、ASF356和Lachnospiraceae_NK4A136_group的相对丰度。

4. 讨论

本研究揭示了从Treg缺陷的SF小鼠分离的炎症性CD4⁺T细胞，能够在免疫缺陷宿主中诱发肝脏炎症，其机制涉及巨噬细胞浸润、促炎/代谢基因谱的广泛重编程、RNA剪接改变以及肠道菌群扰动。而经益生菌罗伊氏乳杆菌DSM 17938“教育”后的CD4⁺T细胞，则能显著减轻这些病理变化，通过调节特定的TLR/NF-κB信号节点（如Tank, Cul1）、下调关键促炎因子（如Lcn2）、部分恢复代谢通路、减少异常RNA剪接，并微调特定细菌类群，从而发挥肝脏保护作用。这些发现表明，益生菌或益生菌调节的T细胞，通过介导复杂的T细胞-巨噬细胞-线粒体-肠道菌群对话，为自身免疫性肝病（AILD）的治疗提供了新的潜在策略。未来需要进一步阐明益生菌代谢物（如腺苷/肌苷）如何精确塑造CD4⁺T细胞表型，并验证其在临床应用中的潜力。