无标记、单细胞、代谢成像与数字评分：中红外光声显微技术揭示脂肪组织重塑新视角

《Advanced Science》：Single-Cell Metabolic Imaging and Digital Scoring of Fat Tissue Remodeling by Label-Free Metabolic Microscopy

本研究通过开发中红外光声显微技术（MiROM），实现了对新鲜、未经处理脂肪组织的快速、无标记、单细胞水平代谢成像。该技术克服了传统光学显微镜依赖外源标记、导致组织变形和耗时样本制备的局限，能够保留组织原生结构。结合定量空间组织分析工具（Q-SAT），研究揭示了白色（WAT）与棕色（BAT）脂肪组织的分子和形态学特征，并首次在出生后发育过程中，在细胞水平上纵向监测了米色脂肪细胞的脂质与蛋白时空分布变化，为理解脂肪组织的可塑性与异质性提供了强大的新工具，在代谢疾病研究与临床诊断方面具有广阔应用前景。

　　

引言：脂肪组织的挑战与新机遇

脂肪组织是控制能量平衡、葡萄糖和脂质代谢的高度可塑且异质的器官，其功能障碍会导致肥胖、糖尿病和心脏代谢疾病等。传统代谢成像技术多依赖外源性标记物，可能干扰生物功能，且通常无法在单细胞水平、保持组织原生结构的情况下进行快速评估。振动光谱学方法，如拉曼散射或中红外（mid-IR）吸收显微镜，提供了无标记化学成像的可能性，但各自存在灵敏度低、水吸收干扰强或需复杂样本制备等问题。中红外光声显微镜（MiROM）作为一种新技术，通过检测光激发产生的声信号，能够从厚达6毫米的新鲜、未处理组织中获取中红外吸收对比度，且样本制备步骤极少，从而为在原生环境下研究脂肪组织代谢动力学和异质性开辟了新途径。

单细胞成像与脂肪组织内在特征鉴定

本研究利用MiROM对小鼠的附睾白色脂肪组织（eWAT）和肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）进行了无标记化学成像。通过结合深度选择性分析和脂肪细胞对比度的数字隔离（轴向与侧向隔离），研究精确评估了脂肪细胞内的分子含量。结果显示，eWAT脂肪细胞的平均直径约为iBAT的3.1倍，而脂肪细胞密度则低约8.5倍。在分子水平，eWAT脂肪细胞在2856 cm^-1（脂质特征，对称CH₂伸缩振动）的对比度是iBAT的约1.7倍，表明其脂质含量更高；相反，iBAT脂肪细胞在1550 cm^-1（蛋白质特征，酰胺II带）的对比度是eWAT的约3.4倍，反映了其更高的蛋白质（可能与更丰富的线粒体有关）含量。光谱分析进一步证实了这些差异：在CH₂振动区域（2932–2778 cm^-1）和CO振动区域（1128–1080 cm^-1），eWAT的信号强度约为iBAT的两倍；而在酰胺I和II带（1700–1500 cm^-1），iBAT的信号强度约为eWAT的2.8倍。主成分分析（PCA）清晰地基于光谱特征将eWAT和iBAT脂肪细胞分为两个独立的簇，证实了MiROM在形态和分子层面上区分白色与棕色脂肪组织的能力。

出生后脂肪组织重塑的纵向无标记监测

研究利用小鼠腹股沟白色脂肪组织（iWAT）在出生后2-6周经历的剧烈但短暂的“褐化”（browning，第2-4周）和“白化”（whitening，第4-6周）重塑过程作为模型，测试MiROM监测细胞内分子和形态变化的能力。成像显示，从第2周到第4周，iWAT脂肪细胞尺寸减小（增生），从第4周到第6周，尺寸增大（肥大）。同时，2856 cm^-1的脂质对比度在第2-4周下降，第4-6周上升；而1550 cm^-1的蛋白对比度则呈现相反趋势。这些变化与褐化（增加产热蛋白如UCP1）和白化过程相符，并通过蛋白质印迹、H&E染色和全组织免疫荧光染色得到验证。光谱分析显示，iWAT脂肪细胞的光谱特征在褐化期向iBAT样转变，在白化期则向eWAT样回归。通过基于eWAT和iBAT光谱训练的逻辑回归模型进行组织评分，量化结果显示，在iWAT中，光谱上更类似eWAT的脂肪细胞比例在第2-4周减少、第4-6周增加，而更类似iBAT的细胞比例则呈现相反趋势，清晰地描绘了组织褐化与白化的轨迹。

基于机器学习的定量空间分析与数字评分

为克服手动选择分析区域可能带来的偏差，并获得组织水平的空间异质性信息，研究开发了定量空间分析工具（Q-SAT）。Q-SAT基于10个精选波数（2856, 1632, 1550, 1454, 1376, 1238, 1134, 1086, 1046, 990 cm^-1）的MiROM高光谱成像数据，利用逻辑回归模型对每个像素进行数字化评分，预测其呈现白色脂肪（WAT）样或棕色脂肪（BAT）样特征的概率。与采集502个波数的全高光谱数据相比，此方法将成像时间从约67小时大幅缩短至80分钟。应用Q-SAT对iWAT出生后不同周龄的组织进行成像分析，生成了数字评分图，直观展示了WAT样和BAT样表型在组织中的空间分布。定量分析显示，iWAT的整体标准化WAT评分在褐化期（第2-4周）下降，在白化期（第4-6周）上升；标准化BAT评分则呈现相反趋势。此外，平均NBAT评分与免疫荧光测得的UCP1蛋白平均荧光强度呈强正相关（r = 0.95）。通过将评分图划分为网格并计算变异系数（CV），研究还量化了表型分布的空间异质性，发现出生后重塑是一个空间局部化的过程，WAT样和BAT样表型形成了镶嵌状的富集区域。

讨论与展望

本研究证明了MiROM能够在保持组织原生结构的前提下，以深度选择性和无标记的方式，定量监测新鲜未处理脂肪组织中的细胞内生物分子变化。该技术成功区分了eWAT和iBAT的形态与分子特征，并纵向监测了iWAT出生后的动态重塑过程。结合Q-SAT，研究实现了对脂肪细胞表型空间分布的无偏、数字化评估。MiROM/Q-SAT技术为在体研究组织生理和病理提供了一个强大的工具。未来，将MiROM读数与质谱辅助的深度脂质组学和蛋白质组学相结合，可以更深入地揭示脂肪细胞的单分子组成。虽然Q-SAT通过减少波数提高了成像速度，但点扫描式的成像速度仍受机械平台限制。未来可通过采用振镜/MEMS扫描、多波长同时采集、提高激光重复频率（高达2MHz）以及结合贝叶斯图像重建的稀疏数据采集等策略来进一步提升速度。总之，MiROM与Q-SAT的结合，为理解脂肪组织的代谢可塑性提供了新的细胞内视角，并有望扩展应用于评估代谢疾病干预措施（如药物或环境诱导的褐化），以及其他脂质驱动病理（如脂肪肝疾病）的定量、空间分辨的无标记组织学分析。