《Advanced Science》：Divergent Regulatory Effects of Jasmonic Acid on Tomato Lycopene Biosynthesis Under Light and Dark Conditions
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本文是一项关于植物激素茉莉酸（JA）如何调控番茄果实着色的前沿研究。作者揭示了JA在光下促进、暗中抑制番茄红素合成的“双向调控”新机制，核心在于光信号负调控因子SlPIF1a。研究发现，在光照下，JA通路核心转录因子SlMYC2通过抑制SlPIF1a并直接激活关键基因SlPSY1来促进番茄红素合成；而在黑暗中，JA诱导的乙酰转移酶SlNATA1会乙酰化积累的SlPIF1a，从而强烈抑制SlPSY1表达。该研究阐明了JA与光信号交叉对话调控次级代谢产物的精细分子网络，为利用JA精准调控果蔬采后成熟与品质提供了重要理论依据。
茉莉酸（JA）在光暗条件下对番茄番茄红素生物合成的双向调控机制
1 引言
番茄果实因其风味和营养价值被广泛食用。类胡萝卜素是番茄中的主要色素和必需营养成分，对人体健康至关重要，同时也是评估番茄果实成熟过程的关键指标。在高等植物中，类胡萝卜素生物合成的前体是通过质体定位的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径合成的异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。八氢番茄红素合酶（PSY）是类胡萝卜素生物合成中的主要限速酶。在番茄中，已鉴定出三个同源的PSY基因，其中SlPSY1过表达显著增加了生物合成速率和总类胡萝卜素含量。
光是一个影响番茄果实类胡萝卜素生物合成的重要环境信号。植物在光照和黑暗条件下表现出不同的发育模式，分别称为光形态建成和暗形态建成。光敏色素（phys）在这些过程中起关键作用。在黑暗中，光敏色素相互作用因子（PIFs）在细胞核中积累，促进暗形态建成。在光照下，活跃的光敏色素phyB与PIFs相互作用，诱导其泛素化和降解。此前研究表明，转录因子SlPIF1a抑制番茄果实中的番茄红素生物合成，而SlHY5过表达则增强番茄红素积累。
茉莉酸（JAs）是天然存在的植物激素，已知可调节包括类胡萝卜素生物合成在内的多种生理过程。在植物中，具有生物活性的茉莉酰-L-异亮氨酸（JA-Ile）与其受体CORONATINE INSENSITIVE 1（COI1）结合，导致JASMONATE ZIM-DOMAIN（JAZ）阻遏蛋白的降解，并激活下游转录因子如MYC2。在番茄果实中，叶面喷洒茉莉酸甲酯（MeJA）可增加类胡萝卜素积累，并上调类胡萝卜素生物合成基因如SlPSY1和SlPDS的表达。然而，也有相反的研究结果报道。近期研究结果表明，光和JA信号相互作用以调节花青素等次级代谢物。尽管大量研究证明JA影响果实成熟、耐冷性和抗病性，但其在果实成熟中的具体调控机制仍存在争议。这些不一致之处限制了JA在农业生产中的实际应用。与JA介导的花青素合成调控类似，作者假设关于JA对类胡萝卜素含量影响的矛盾报告可能与光照条件的差异有关。
2 结果
2.1 MeJA在光暗条件下对番茄果实类胡萝卜素积累表现出相反效应，且不依赖于乙烯途径
在绿熟期（MG）对采后番茄果实施用MeJA表明，JA对类胡萝卜素生物合成和果实着色的影响因光照暴露而异。在光照条件下，JA促进类胡萝卜素合成，而在黑暗中，效果则相反。详细的类胡萝卜素分析显示，在光照下，经MeJA处理的果实积累了显著更高水平的番茄红素和β-胡萝卜素，但叶黄素水平较低；相比之下，黑暗中的番茄红素和β-胡萝卜素含量下降，叶黄素无变化。在JA高度积累的Slst2a突变体果实中进一步证实了这一表型。RT-qPCR分析表明，MeJA在光照下显著上调关键类胡萝卜素生物合成基因的表达，而在黑暗条件下，MeJA处理导致这些基因表达整体下降，其中SlPSY1表现出最强的抑制。因为质体是番茄果实中类胡萝卜素储存的主要细胞器，作者还检测了目前唯一已知的质体发育关键调节因子SlOR的表达。JA在光暗条件下均一致地上调了SlOR的表达。这些结果表明，JA介导的类胡萝卜素含量调节是光依赖性的，并可能通过对类胡萝卜素生物合成基因的转录调控起作用。
乙烯是番茄果实类胡萝卜素生物合成的关键调节因子。为了确定JA的效应是否涉及乙烯信号，作者分析了在光暗条件下施用MeJA后乙烯生物合成基因的表达。与之前的研究一致，SlACS2和SlACO1在MeJA处理后显著上调，与光照暴露无关，且调节方向没有变化。这表明MeJA对类胡萝卜素生物合成的双向调节独立于乙烯途径。
2.2 SlPIF1a对黑暗条件下番茄红素含量的降低至关重要
由于MeJA对类胡萝卜素积累的影响取决于光照，且先前工作表明光独立于乙烯信号调节类胡萝卜素生物合成，因此MeJA的双向调节可能源于JA和光信号通路之间的交叉对话。据报道，SlPIF1a以光依赖的方式通过抑制SlPSY1表达来负调控类胡萝卜素生物合成。PIF蛋白家族通常作为光信号的负调节因子，在弱光条件下积累并抑制下游光响应基因的表达。为了阐明SlPIF1a在类胡萝卜素调节中的作用，使用CRISPR/Cas9系统生成了两个SlPIF1a突变体系（Slpif1a-1和Slpif1a-2）。同时，在35S启动子控制下创建了两个SlPIF1a-FLAG过表达系（OE-SlPIF1a-1和OE-SlPIF1a-2）。RT-qPCR证实这些品系中的SlPIF1a转录水平比野生型（WT）高四到五倍。
分析了SlPIF1a转基因和WT品系果实在光暗条件下的番茄红素、β-胡萝卜素和叶黄素含量。在光照下，Slpif1a突变体系表现出比WT显著更高的番茄红素水平，而过表达系与WT相比没有差异，尽管SlPIF1a转录水平增加了五倍。在黑暗条件下，Slpif1a突变体中的番茄红素水平仍然较高，但过表达系中的番茄红素水平明显低于WT。这些结果表明，光诱导的SlPIF1a降解可能起关键调节作用。为了验证这一点，作者测量了WT和OE-SlPIF1a-1品系在光暗条件下SlPIF1a蛋白的积累。结果证实，在黑暗中OE-SlPIF1a-1品系中SlPIF1a蛋白水平较高，而在光照下两个品系均未检测到可观察的SlPIF1a蛋白。还量化了SlPIF1a转基因品系中的β-胡萝卜素和叶黄素含量。在光暗条件下，过表达系中的β-胡萝卜素含量均显著低于WT，而Slpif1a突变体与WT之间未检测到显著差异。此外，叶黄素含量的变化与SlPIF1a表达水平无关。总之，这些结果表明SlPIF1a主要调节番茄果实中的番茄红素积累。
RT–qPCR分析显示，在光暗条件下，Slpif1a突变体系中的SlPSY1表达均高于WT，而过表达系中仅在黑暗条件下SlPSY1表达显著降低。这些发现表明SlPIF1a在光暗条件下调节番茄红素积累中起重要作用。为了进一步探索SlPIF1a的调节范围，作者检测了黑暗条件下其他关键类胡萝卜素生物合成基因的表达。结果表明，SlPIF1a负调节SlPDS表达，但对SlDXS或SlGGPS没有显著影响。此外，质体形成基因SlOR的表达不受SlPIF1a影响。总之，这些结果证明SlPIF1a对番茄果实类胡萝卜素生物合成的调节作用主要发生在类胡萝卜素途径的初始阶段——具体来说，是在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）向番茄红素转化期间——而不是通过调节MEP途径。
2.3 JA对番茄红素含量的调节取决于SlPIF1a
为了确定SlPIF1a是否介导JA对类胡萝卜素生物合成的双向调节，作者首先证实了番茄果实中SlMYC2的表达被MeJA上调。相比之下，SlPIF1a的表达在WT中被MeJA显著抑制，但在先前被鉴定为SlMYC2-KO-3的Slmyc2突变体系中保持不变。在携带JA受体突变的jai1-1突变体中观察到了类似的结果。在jai1-1中，SlPIF1a转录水平显著高于WT，并且MeJA诱导的抑制显著减弱。在不同光照条件下对Slmyc2果实进行的类胡萝卜素分析表明，在光照下，所有类胡萝卜素水平均显著低于WT。在黑暗条件下，番茄红素含量无显著差异，而β-胡萝卜素和叶黄素略低。这些结果表明JA对类胡萝卜素的光依赖性调节涉及SlMYC2–SlPIF1a模块。
MYC2是JA信号通路中的核心转录因子，已知可通过结合其启动子来激活PSY1表达。为了阐明MeJA如何影响SlPIF1a，作者分析了先前发布的ChIP-seq数据，并将SlPIF1a鉴定为SlMYC2的直接靶标。在SlPIF1a的3.5 kb启动子区域内检测到三个G-box。将它们分成两个片段（P1和P2）并插入pGreenII 0800-miniLUC载体，同时将SlMYC2 CDS克隆到pGreenII 62-SK载体中。双荧光素酶报告基因检测显示，与对照相比，SlMYC2抑制了由P2启动子驱动的LUC表达，但对P1没有抑制。酵母单杂交（Y1H）检测证实了SlMYC2与SlPIF1a启动子的直接结合。将SlPIF1a启动子的G-box（CACATG）片段插入pLACZi载体，并将SlMYC2 CDS克隆到pGAD424中。在YM4271酵母菌株中的共表达证明了SlMYC2与SlPIF1a启动子的结合，这通过电泳迁移率变动分析（EMSA）进一步验证。总之，这些数据表明JA通过SlMYC2的直接靶向抑制SlPIF1a转录。
为了测试SlPIF1a是否介导JA对番茄红素生物合成的双向调节，在光暗条件下用MeJA处理SlPIF1a转基因和WT番茄果实，并测量了番茄红素、β-胡萝卜素和叶黄素含量。在光照下，Slpif1a突变体和WT果实的番茄红素均增加，但SlPIF1a过表达系在MeJA处理后番茄红素显著下降。在黑暗中，WT果实表现出下降，而过表达系表现出与光照下类似的模式。在Slpif1a突变体中，JA处理后番茄红素水平也下降，但下降幅度显著弱于WT，表明与其他PIF蛋白存在功能冗余。在光照下，WT和Slpif1a-1果实中的β-胡萝卜素水平均显著增加，而在其他基因型中未观察到显著变化。在黑暗条件下，JA对所有品系的β-胡萝卜素水平均表现出普遍的抑制趋势。叶黄素含量在各基因型间没有一致的模式。总体而言，这些结果表明SlPIF1a的积累调节了JA对番茄红素生物合成的调节效应。
2.4 SlPIF1a依赖SlMYC2抑制SlPSY1表达
先前的研究报道SlPIF1a结合SlPSY1启动子中的PBE-box，但尚未证明直接抑制SlPSY1表达。为了测试这一点，作者首先证实了SlPIF1a定位于细胞核。然后使用本氏烟草叶片进行双荧光素酶检测以研究调节机制。效应子构建体包含由35S启动子驱动的SlPIF1a CDS，报告构建体携带含有PBE-box的SlPSY1启动子片段与LUC基因融合。出乎意料的是，当与SlPIF1a共表达时，由SlPSY1启动子驱动的LUC活性与对照相比没有差异。为了排除SlPIF1a降解影响结果的可能性，蛋白质印迹分析证实了SlPIF1a在本氏烟草叶片中的成功表达和积累。这些发现与RT-qPCR数据形成对比，在RT-qPCR数据中Slpif1a突变体中的SlPSY1表达高于WT，这表明可能另一种蛋白质与SlPIF1a合作抑制类胡萝卜素生物合成。
由于PIF4在拟南芥中与MYC2相互作用，作者研究了SlMYC2是否与SlPIF1a相互作用以调节类胡萝卜素生物合成。荧光素酶互补成像（LCI）检测证实了它们的相互作用，这通过双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）检测进一步验证。
为了进一步评估SlPIF1a和SlMYC2如何影响SlPSY1表达，通过在本氏烟草叶片中共表达SlPIF1a、SlMYC2和SlPSY1启动子进行了双荧光素酶检测。结果显示，SlMYC2强烈激活SlPSY1表达，而SlPIF1a消除了这种激活。然而，无论是单独的SlPIF1a还是SlMYC2和SlPIF1a的共表达，与对照相比均未降低LUC活性。这些发现表明，SlPIF1a通过与SlMYC2相互作用并干扰其SlPSY1的转录激活来抑制SlPSY1表达。
2.5 SlPIF1a的N端结构域与SlMYC2相互作用并在干扰SlPSY1激活中起主导作用
为了阐明SlPIF1a如何干扰SlMYC2对SlPSY1的激活，作者假设SlMYC2中与SlPIF1a相互作用的区域对应于负责激活SlPSY1表达的同一结构域，表明这些元件之间存在竞争性相互作用。为了确定具体的相互作用区域，将SlPIF1a和SlMYC2都分为N端和C端片段，分别克隆到pGBKT7载体中并测试自激活。两种蛋白质的N端区域均表现出转录激活活性。进行酵母双杂交（Y2H）检测以测试SlPIF1a的C端区域（SlPIF1aC）与全长SlMYC2之间的相互作用，以及SlMYC2的C端区域（SlMYC2C）与全长SlPIF1a之间的相互作用。SlPIF1aC与SlMYC2不相互作用，SlMYC2C与SlPIF1a也不相互作用，表明这些蛋白质之间的相互作用位点位于它们的N端区域。LCI实验证实了这一发现：只有当SlPIF1aN（SlPIF1a的N端区域）与SlMYC2共表达，或者SlMYC2N（SlMYC2的N端区域）与SlPIF1a共表达时，才在本氏烟草叶片中检测到荧光信号。
使用Y1H分析来确定SlMYC2N是否结合SlPSY1启动子。正如预期，SlMYC2N直接结合SlPSY1启动子，而SlMYC2C则不结合。这些结果表明，SlPIF1aN与SlMYC2的结合结构域相互作用，该结构域通常与SlPSY1启动子结合，从而抑制SlMYC2的结合。通过在本氏烟草叶片中共表达SlMYC2和SlPSY1启动子以及SlPIF1aN或SlPIF1aC进行了双荧光素酶（Dual-LUC）检测。结果显示，SlPIF1aN抑制了SlMYC2介导的SlPSY1激活，而SlPIF1aC则没有。
在获得的Slpif1a突变体中，一个独特的品系（Slpif1a-3）包含一个N端突变，涉及第46位的七个核苷酸缺失和第175位的一个核苷酸插入，导致移码，从而废除了SlPIF1aN功能。脱靶分析证实了CRISPR/Cas9诱导突变的具体性和可靠性。LCI检测显示，Slpif1a-3中SlPIF1a的截短N端区域不再能与SlMYC2相互作用。Slpif1a-3品系的果实含有显著高于WT的番茄红素水平，而β-胡萝卜素和叶黄素含量不变。这一表型支持了SlPIF1aN与SlMYC2之间的相互作用干扰SlMYC2介导的SlPSY1转录激活的假设。
这些结果阐明了JA在光照条件下通过SlPIF1a调节番茄红素生物合成的机制：在经MeJA处理的番茄果实中，激活的SlMYC2抑制SlPIF1a表达，从而防止对SlPSY1激活的干扰。
2.6 SlPIF1a和SlNATA1的共同积累显著抑制番茄红素生物合成
有趣的是，在MeJA处理后，Slpif1a-3果实中的番茄红素含量显著下降，这与在黑暗中用MeJA处理的WT果实中观察到的下降一致。为了检验这种效应，作者分析了Slpif1a-3的蛋白质结构，发现负责通过与phyB相互作用导致SlPIF1a泛素化和降解的APB结构域在Slpif1a-3蛋白质中被破坏。最近的一项研究表明，光诱导phyB的光敏色素特异性（PHY）结构域发生构象变化，将β-片层转化为α-螺旋，从而促进其与PIF6的APB结构域的相互作用。作者假设APB结构域突变导致SlPIF1a在Slpif1a-3品系中过度积累，改变了MeJA诱导的番茄红素生物合成抑制。为了验证这一假设，将WT、Slpif1a-1和Slpif1a-3品系的果实在光暗条件下储存，并测量了SlPIF1a蛋白水平。在WT中，与光照相比，SlPIF1a蛋白在黑暗中显著积累。在Slpif1a-1中，两种条件下均未检测到SlPIF1a，而在Slpif1a-3中，无论光照暴露如何，SlPIF1a都会积累。这些发现表明，Slpif1a-3形式的SlPIF1a在光照下不能被泛素化，这支持了作者的假设，即SlPIF1a的积累改变了JA介导的番茄红素生物合成调节。
为了进一步研究JA对SlPIF1a积累的负调节，作者进行了Y2H筛选以鉴定与SlPIF1a相互作用的蛋白质。在38个已鉴定的候选者中，有一个编码乙酰转移酶，先前报道其对MeJA有反应并赋予拟南芥对根肿病的抗性。RT-qPCR分析显示，SlNATA1表达在番茄果实成熟期间急剧下降，但被MeJA处理强烈诱导。双荧光素酶检测显示，在本氏烟草叶片中共表达SlPIF1a、SlNATA1和SlPSY1启动子显著抑制了SlPSY1表达，而共表达SlNATA1和SlPSY1启动子（不含SlPIF1a）则没有抑制。Y1H检测进一步证明SlPIF1a直接结合SlPSY1启动子，而SlNATA1则不结合。这些结果表明SlPIF1a–SlNATA1模块介导了MeJA对番茄红素生物合成的负调节。
2.7 SlNATA1通过乙酰化SlPIF1a负调节番茄红素生物合成
LCI检测证实了SlPIF1a和SlNATA1之间的物理相互作用，显示SlPIF1aN和SlPIF1aC都能与SlNATA1相互作用。鉴于SlNATA1作为乙酰转移酶发挥作用，作者假设它通过乙酰化SlPIF1a来抑制SlPSY1表达。
为了测试这一点，将带有FLAG标签的SlPIF1a（SlPIF1a-FLAG）和带有MYC标签的SlNATA1（SlNATA1-MYC）在本氏烟草叶片中共表达，单独的SlPIF1a-FLAG作为对照。与SlNATA1共表达显著增加了SlPIF1a的乙酰化水平，而总SlPIF1a蛋白保持不变。体外乙酰化检测支持了这些发现。从原核表达系统中纯化了SlPIF1a-His和SlNATA1-GST融合蛋白。增加SlNATA1-GST的浓度导致SlPIF1a-His的乙酰化水平升高，证实SlNATA1乙酰化SlPIF1a。此外，在光暗条件下，均未检测到MeJA对番茄果实中SlPIF1a蛋白丰度的显著影响，这进一步表明MeJA可能通过乙酰化而不是调节其蛋白积累来调节SlPIF1a功能。为了确定SlNATA1在番茄红素生物合成中的作用，在35S启动子下产生了过表达系（OE-NATA1-1和OE-NATA1-2）。RT-qPCR证实，与WT相比，这些品系中SlNATA1的表达分别高出13倍和45倍。蛋白质印迹分析证实了两个过表达系中SlNATA1-FLAG蛋白的成功积累。作者首先检测了MeJA处理前后OE-NATA1-1植株中SlNATA1蛋白水平的变化。结果显示，MeJA在光暗条件下均促进了番茄植株中SlNATA1蛋白的积累。SlNATA1过表达系中的果实着色进展显著慢于WT果实，表明SlNATA1在黑暗条件下负调节番茄果实中的番茄红素生物合成。此外，在自然条件下，过表达系的果实成熟明显晚于WT。为了进一步阐明SlPIF1a-SlNATA1-SlPSY1通路与SlMYC2-SlPSY1通路之间的层级关系，作者检测了当三种蛋白质与SlPSY1启动子在烟草瞬时表达系统中共表达时SlPSY1启动子活性的变化。结果显示，当所有三种蛋白质同时存在时，SlPSY1启动子活性显著降低，这与仅在SlPIF1a和SlNATA1组中观察到的效果一致。这些结果进一步表明，在黑暗条件下，MeJA优先激活SlPIF1a-SlNATA1介导的调节SlPSY1表达的抑制通路。
总之，本研究证明JA以光依赖的方式通过SlPIF1a调节番茄红素生物合成。在光照条件下，JA激活SlMYC2，从而抑制SlPIF1a表达并促进SlPSY1激活。在黑暗条件下，外源JA诱导乙酰转移酶SlNATA1的表达，该酶通过乙酰化黑暗诱导积累的SlPIF1a来抑制SlPSY1。这些发现强调，在将JA用作采后成熟剂时，应仔细考虑光照暴露。
3 讨论
3.1 JA在番茄红素合成中的调节作用是双向的
JA是一种重要的植物信号分子，已知可调节类胡萝卜素生物合成。早期研究报告，用MeJA熏蒸采后番茄果实显著增强了番茄红素合成。类似地，在绿熟果实上外源喷洒JA与对照相比显著增加了番茄红素积累，而JA缺陷突变体（spr2和def1）的番茄红素含量比WT低近40%。本研究表明，JA对番茄红素合成的调节是双向的，并受光照影响。在光照下，JA促进番茄红素生物合成，而在黑暗中，JA强烈抑制它。RT–qPCR分析显示，在类胡萝卜素生物合成基因中，SlPSY1在光暗条件下对JA的反应表现出最显著相反的表达趋势。负责将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）转化为番茄红素的酶编码基因表现出类似的行为。这可能解释了为何当MeJA在羊毛脂中应用时会观察到番茄红素积累减少——羊毛脂可能降低了番茄表面的光渗透性，减弱了JA的促进作用。此外，质体生物发生关键基因SlOR的表达不受光照或黑暗中JA的影响，表明JA对类胡萝卜素的光依赖性调节不是通过SlOR发生的。总体而言，JA对类胡萝卜素积累的促进作用可能作用于类胡萝卜素生物合成和储存的多个阶段。然而，其光依赖性的双向调节主要针对GGP
