《Advanced Science》：Inhibiting cGAS-STING to Preserve Mitochondrial–Nuclear Communication and Stemness in Young Tendon Stem Cells: A Hydrogel Strategy against Age-Related Tendinopathy
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本研究报道了一种新型活性氧（ROS）响应性双靶向水凝胶（P/H@Lipo）系统，用于协同调控肌腱源性干细胞（TDSC）的线粒体-核通讯，以治疗年龄相关性肌腱病。该系统可响应肌腱炎性微环境中高水平的ROS，精准释放负载的靶向性硒纳米催化剂（HPSe）和STING抑制剂H-151递送脂质体（L-Lipo@H-151）。两者协同作用，一方面通过清除ROS、保护线粒体功能减少线粒体DNA（mtDNA）泄漏，另一方面直接抑制cGAS-STING通路，从而有效阻断衰老相关分泌表型（SASP）产生，维持年轻TDSC的干性，并促进巨噬细胞向抗炎M2表型复极化，为年龄相关性肌腱病的治疗提供了“靶向递送-多通路协同”的创新策略。
年轻与衰老肌腱源性干细胞（TDSC）的功能差异
研究首先系统比较了来自年轻（4月龄）与衰老（18月龄）肌腱的TDSC功能。免疫荧光与蛋白印迹分析显示，衰老TDSC中关键的肌腱生成相关蛋白，如I型胶原（COL I）、腱调蛋白（TNMD）、Mohawk同源盒蛋白（MKX）和硬骨调蛋白（SCX）的表达水平显著降低。相反，衰老标志物P16和P21的表达则显著上调。功能学实验进一步证实，衰老TDSC的增殖、迁移能力下降，且在成骨和成脂诱导下更容易发生异常分化，形成更多的钙化结节和脂滴。这些结果表明，衰老TDSC的功能活性减退和病理性的转分化倾向，是肌腱再生失败的关键因素。因此，开发策略以延缓年轻TDSC的衰老、维持其干性和功能，对于治疗年龄相关性肌腱病至关重要。
HPSe纳米催化剂的合成与表征
为构建靶向递送系统，研究合成了CD44靶向的硒纳米催化剂（HPSe）。通过将苯硼酸（PBA）接枝到透明质酸（HA）上形成HA-PBA，再利用抗坏血酸还原硒酸钠，成功制备了HPSe纳米颗粒。表征结果显示，HPSe呈均匀球形分布，粒径约为90纳米，具有良好的分散稳定性。X射线光电子能谱（XPS）和X射线衍射（XRD）证实了元素硒的成功合成。过氧化氢清除实验证明HPSe具有显著的ROS清除能力，在200 μg/mL浓度下清除率可达82.4%。细胞毒性实验表明该浓度下HPSe具有良好的生物相容性，因此被选为后续实验的工作浓度。重要的是，HPSe中的HA保留了靶向CD44受体的能力，而TDSC和巨噬细胞均高表达CD44，这为后续的细胞特异性靶向提供了基础。
脂质体与水凝胶系统的构建、表征及双靶向验证
研究同时构建了负载STING抑制剂H-151的靶向脂质体（L-Lipo@H-151）。该脂质体表面修饰了I型胶原特异性结合肽（LHERHLNNN），可主动靶向高表达并分泌I型胶原的年轻TDSC。表征显示脂质体粒径均一，药物包封率约为82.7%，并能实现H-151的持续释放。靶向验证实验表明，修饰靶向肽的脂质体对TDSC的摄取效率显著增强。
随后，将聚乙烯醇（PVA）、HPSe和L-Lipo@H-151直接混合，通过PVA的羟基与HA-PBA的苯硼酸基团形成动态硼酸酯键，成功构建了ROS响应性双靶向水凝胶系统（P/H@Lipo）。该水凝胶具有多孔结构、优异的可注射性和自愈能力。扫描电镜显示硒纳米颗粒均匀分布在水凝胶基质中。流变学测试表明其具有稳定的凝胶特性。傅里叶变换红外光谱检测到B-O键的特征吸收峰，证实了硼酸酯交联结构的存在。ROS响应性释放实验证明，在H2O2存在下，水凝胶中硒的释放显著高于PBS组，表明其能响应炎性微环境中的高ROS水平实现按需释药。细胞摄取实验进一步证实，HPSe可通过CD44受体介导的内存作用高效被TDSC和巨噬细胞摄取，而L-Lipo@H-151则通过肽介导的靶向作用富集于TDSC，实现了系统的双靶向功能。
P/H@Lipo通过调控线粒体-核通讯减轻年轻TDSC衰老
在H2O2模拟的炎性微环境中，P/H@Lipo展现出优异的抗衰老效果。免疫荧光和蛋白印迹分析显示，P/H@Lipo能显著降低年轻TDSC中衰老标志物P16和P21的表达。同时，它有效抑制了cGAS-STING信号通路及其下游NF-κB通路关键蛋白p65的磷酸化。机制上，P/H@Lipo发挥了双重协同作用：HPSe有效清除了细胞内ROS，保护了线粒体结构和功能，减少了线粒体DNA（mtDNA）向细胞质的泄漏；而L-Lipo@H-151则直接递送H-151抑制STING蛋白，阻断了由泄漏mtDNA激活的cGAS-STING通路。双链DNA免疫荧光和qPCR检测均证实P/H@Lipo处理显著降低了胞质中mtDNA水平。透射电镜观察显示，P/H@Lipo改善了H2O2诱导的线粒体肿胀和膜结构变形，并提升了细胞ATP水平。这些结果表明，P/H@Lipo通过协同调控线粒体-核通讯，有效延缓了年轻TDSC在炎性微环境中的衰老进程。
P/H@Lipo缓解氧化应激导致的功能抑制、DNA损伤与凋亡
P/H@Lipo还能有效维持年轻TDSC的肌腱生成功能。免疫荧光显示，它能逆转H2O2对COL I、TNMD、MKX和SCX等肌腱功能蛋白表达的抑制。同时，P/H@Lipo显著减轻了H2O2诱导的DNA损伤（γ-H2AX阳性信号减少）和细胞凋亡（TUNEL及Annexin V/PI流式检测凋亡率下降）。蛋白印迹分析也显示，P/H@Lipo下调了促凋亡蛋白Bax的表达，上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。这些结果证明，P/H@Lipo能保护年轻TDSC免受氧化应激导致的的功能损伤和死亡，为其在肌腱修复中发挥作用保留了有生力量。
P/H@Lipo增强年轻TDSC增殖迁移，延缓衰老并抑制异常分化
功能恢复实验进一步证实了P/H@Lipo的益处。平板克隆形成实验和细胞划痕实验表明，P/H@Lipo处理显著提升了年轻TDSC的增殖和迁移能力。经过成骨/成脂诱导后，阿利新红和油红O染色显示，P/H@Lipo有效抑制了H2O2引起的异常成骨和成脂分化倾向。衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色显示，P/H@Lipo处理组的阳性细胞比例显著降低。这些结果表明，P/H@Lipo系统不仅能延缓细胞衰老，还能全面恢复并增强年轻TDSC的自我更新、迁移及维持肌腱向分化的正常功能。
P/H@Lipo降低年轻TDSC炎症水平并调控巨噬细胞复极化
P/H@Lipo对炎性微环境具有强大的调节作用。使用DCFH-DA和MitoSOX Red探针检测发现，P/H@Lipo能有效清除年轻TDSC内及线粒体内的ROS。JC-1和Mito Tracker Red CMXRos检测表明，它有助于稳定线粒体膜电位。钙黄绿素AM检测则显示P/H@Lipo能抑制线粒体通透性转换孔（mPTP）的异常开放。这些作用共同改善了线粒体功能，从源头上减少了炎症诱因。
更重要的是，P/H@Lipo能调控免疫微环境。对共培养的巨噬细胞进行分析发现，HPSe处理能显著降低巨噬细胞内的ROS水平。免疫荧光和流式细胞术结果显示，H2O2刺激促进了巨噬细胞向促炎M1型（iNOS+/CD86+）极化，而P/H@Lipo处理则能显著增加抗炎M2型（CD206+）巨噬细胞的比例，抑制M1型极化。这表明P/H@Lipo能将肌腱局部的免疫微环境从促炎状态扭转为抗炎状态，为TDSC的功能发挥和肌腱修复创造了有利条件。
HPSe调控年轻TDSC增殖分化的机制研究
为深入探究HPSe的作用机制，研究对HPSe处理后的年轻TDSC进行了转录组测序和生物信息学分析。基因集富集分析（GSEA）显示，HPSe干预后，Hippo信号通路、TNF信号通路和NF-κB信号通路均显著下调。KEGG通路富集分析也确认Hippo信号通路是受HPSe调控的显著变化通路之一。基因本体（GO）富集分析表明，上调的差异基因主要集中在细胞分化、DNA损伤修复和细胞粘附等功能，这与HPSe维持细胞增殖、肌腱分化和迁移的表型相一致。随后的蛋白印迹实验进一步在蛋白水平验证了HPSe对Hippo通路关键蛋白的抑制作用：HPSe降低了YAP蛋白的磷酸化水平，使得更多的非磷酸化YAP能够进入细胞核，增强TEAD介导的转录活性。这可能是HPSe维持年轻TDSC干性和自我更新能力的重要分子机制。
P/H@Lipo在体内促进年龄相关性肌腱病修复
最后，研究在18月龄衰老大鼠的胶原酶诱导性肌腱病模型中评估了P/H@Lipo的体内疗效。注射后3周，宏观观察显示P/H@Lipo处理组的肌腱水肿和粘连减轻，形态近乎恢复正常。足迹分析表明该组大鼠的行走功能显著改善。组织学分析显示，P/H@Lipo组肌腱细胞排列更为有序，血管增生减少，Masson染色显示同时存在成熟的红色胶原和新生蓝色胶原，修复状态最佳。免疫组化和免疫荧光染色证实，P/H@Lipo处理显著提升了肌腱中COL I和腱蛋白C（TNC）的表达，并抑制了异位骨化标志物骨钙素（OCN）的表达。CD68/CD206双标免疫荧光显示，P/H@Lipo减少了促炎M1型（CD68+）巨噬细胞浸润，促进了抗炎M2型（CD206+）巨噬细胞极化，与体外结果一致。生物力学测试表明，P/H@Lipo处理显著提高了肌腱的失效应力、杨氏模量和刚度。主要器官切片未发现明显病理改变，表明该系统具有良好的生物安全性。这些结果综合证明，P/H@Lipo水凝胶系统能通过抗氧化、抗衰老、调控免疫微环境等多重协同机制，有效促进年龄相关性肌腱病的结构与功能修复。
结论
本研究通过比较衰老与年轻TDSC的功能差异，揭示了衰老TDSC增殖分化能力显著下降。针对衰老肌腱微环境并存炎症与衰老的特征，研发了ROS响应性双靶向水凝胶系统P/H@Lipo作为核心抗炎抗衰策略。该系统在注射后响应病灶部位升高的ROS，按需释放负载的STING抑制剂靶向脂质体（L-Lipo@H-151）和硒纳米催化剂（HPSe），通过协同调控线粒体-核通讯，有效延缓年轻TDSC衰老并维持其肌腱生成潜能。机制研究表明，HPSe还可通过抑制Hippo信号通路进一步增强TDSC干性。此外，P/H@Lipo能诱导巨噬细胞复极化（M1→M2），改善局部免疫微环境。该研究为年龄相关性肌腱病提出了一种“靶向递送-多通路协同”的治疗新策略。
