《Journal of Hazardous Materials》：Mechanism Study of Phthalate Exposure Promoting Endometriosis: Based on the Ferroptosis Perspective
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本研究通过整合多组学数据及网络毒理学分析，揭示了邻苯二甲酸盐（PAEs）通过激活铁死亡促进上皮间质转化（EMT）进而引发子宫内膜异位症（EM）的机制，并鉴定ARF6为关键调控基因，为EM的环境暴露防治提供新靶点。
王海阳|吴凤萍|李一凡|陈海燕|王欣欣|孙中华|顾宁|朱玉敏
南京大学医学院，中国南京210093
摘要
邻苯二甲酸盐（PAEs）是一类典型的内分泌干扰物（EDCs），它们在人体内积累并引发生殖毒性，与子宫内膜异位症（EM）存在流行病学关联，但其背后的微观机制尚不明确。铁死亡（Ferroptosis）是EM的关键病理驱动因素，但目前关于PAE暴露、铁死亡与EM之间关联的研究仍然不足。本研究整合了批量RNA测序（bulk RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学数据，结合网络毒理学、多组学分析、分子对接以及临床验证，系统探讨了PAE暴露通过铁死亡促进EM的机制。首先，多种机器学习方法确定了ARF6是PAE暴露下与铁死亡相关的关键基因（FRG）。ARF6可能在破坏EM的免疫微环境方面发挥作用，从而为上皮-间充质转化（EMT）创造条件。具体而言，研究发现ARF6的表达与上皮细胞（腔内细胞+纤毛细胞）的干性及间充质细胞（成纤维细胞）的数量显著正相关。据此，本研究构建了一个“高表达ARF6促进腔内细胞+纤毛细胞向成纤维细胞转化”的EM模型。随后，使用scTenifoldKnk算法对成纤维细胞进行ARF6的虚拟敲除实验，以研究其对下游铁死亡基因的干扰作用。结果表明，受干扰的基因在氧化应激反应中显著富集，揭示了ARF6在EMT过程中调节铁死亡机制的作用，并提出了“PAEs - 铁死亡 - EMT - 子宫内膜异位症”这一轴心。总之，这些发现不仅为基于“PAEs-EM”轴心的子宫内膜异位症治疗提供了新的靶点，也为环境暴露预防提供了依据。
引言
邻苯二甲酸盐（PAEs）是一类重要的工业增塑剂，在日常生活中和工业生产中广泛应用，因为它们能提高聚合物材料的柔韧性[1]。由于PAEs与聚合物基质之间缺乏稳定的共价键，在温度升高、pH值波动或光照等不稳定环境下，它们容易从塑料产品中渗出并进入环境介质（空气、水、土壤等）[2]、[3]。例如，先前的研究表明，大气中PAEs的总浓度范围为0.004-33,851 ng·m?3，其中DEHP、DiBP和DBP是主要污染物；在水环境中，PAEs的总浓度范围为0.01-71,980 ng·L?1，DBP是地表水和饮用水中最常见的PAE单体；在土壤中，PAEs的总含量为0.001-820 mg·kg?1，DEHP是主要污染物[4]、[5]、[6]、[7]。人类通过多种途径接触PAEs，包括吸入受污染的空气、摄入受污染的食物以及皮肤接触，导致全球范围内广泛暴露[8]。令人担忧的是，作为典型的内分泌干扰物（EDCs），PAEs的生殖毒性已成为全球公共卫生研究的重点。先前的研究证实了它们对女性生殖健康的危害[9]、[10]。例如，PAEs会干扰卵巢类固醇激素的合成，显著损害卵子质量和早期胚胎发育能力[11]、[12]。此外，多项研究还建立了PAE暴露与子宫内膜异位症（一种高发妇科疾病）发病风险之间的关联[13]。例如，张敏等人利用通济生殖与环境（TREE）队列在356名女性尿液中检测到了PAEs。结果显示，对照组中MiBP、MBzP、MEHP和ΣDEHP的几何平均值分别为20.19 ng/mL、0.06 ng/mL、3.89 ng/mL和0.13 ng/mL；而在子宫内膜异位症组中，这些数值分别上升至28.48 ng/mL、0.10 ng/mL、6.24 ng/mL和0.16 ng/mL，组间存在显著差异，逻辑回归分析表明PAE暴露与子宫内膜异位症风险呈正相关[14]。尽管流行病学证据将PAEs与子宫内膜异位症联系起来，但PAE调节子宫内膜异位症发展的具体分子机制——尤其是涉及细胞信号通路激活和关键分子靶点调控的详细机制——仍需进一步阐明。
子宫内膜异位症是一种妇科疾病，其特征是子宫内膜样组织在子宫腔外异常植入，典型症状包括慢性盆腔疼痛、进行性痛经、性交痛和不孕[15]。从疾病负担来看，全球子宫内膜异位症患者的直接和间接医疗费用每年接近每人10,000欧元，给个人和医疗系统带来了沉重负担[16]。高昂的治疗费用和日常不便促使研究人员进行更深入的病理学研究，以缓解患者面临的多种压力。值得注意的是，铁死亡也被确定为子宫内膜异位症的关键病理驱动因素[17]。多项研究表明，子宫内膜异位症患者的异位子宫内膜组织中脂质过氧化产物和铁死亡相关基因（FRGs）的表达显著升高，表明失调的铁死亡可能通过促进异位子宫内膜细胞的异常存活和增殖来参与疾病发生[14]、[18]。此外，氧化应激——子宫内膜异位症的关键病理特征——不仅直接导致子宫内膜细胞DNA损伤，还加速了细胞的侵袭和血管生成[14]、[19]。然而，目前关于PAE暴露、铁死亡和子宫内膜异位症之间相互作用的研究仍不充分。虽然已有研究表明PAE可通过诱导氧化应激促进子宫内膜异位症的发展，但关于PAE是否通过调节铁死亡途径影响该过程，以及铁死亡是否介导“PAEs-子宫内膜异位症”轴心的证据尚缺乏。解决这些科学问题将为阐明与环境暴露相关的子宫内膜异位症发病机制提供理论基础。
基于上述科学问题，本研究通过整合包括批量RNA测序、单细胞RNA测序和空间转录组学在内的多组学数据，结合网络毒理学、多组学分析、分子对接和临床样本的实验验证，系统研究了PAE暴露与子宫内膜异位症之间的关系。首先，我们确定了PAE暴露下失调的铁死亡相关基因（FRGs），富集分析显示它们在EMT相关通路中显著富集，为“铁死亡-子宫内膜异位症”轴心提供了新的见解。随后，十二种机器学习方法确定ARF6是PAE暴露下的关键FRG，表明其在破坏子宫内膜异位症免疫微环境方面的潜在作用。值得注意的是，ARF6介导的免疫微环境破坏也为其促进EMT创造了条件，单细胞RNA测序进一步证实了其促进EMT的能力。具体而言，研究发现ARF6的表达与上皮细胞（腔内细胞+纤毛细胞）的干性和间充质细胞（MSCs、成纤维细胞）的数量显著正相关。伪时间分析还显示了其在EMT过程中的调节作用。然后，使用scTenifoldKnk算法对成纤维细胞进行ARF6的虚拟敲除实验，以研究其对下游铁死亡基因的干扰作用。结果表明，受干扰的基因在氧化应激反应、蛋白质磷酸化调节以及细胞间粘附和伤口愈合过程中显著富集，揭示了ARF6在EMT过程中调节铁死亡机制的作用。最终，免疫组化（IHC）证实了子宫内膜异位症中ARF6的表达失调，而免疫荧光（IF）显示其与EMT相关细胞的共定位，为ARF6作为子宫内膜异位症的新靶点及其环境可预防性提供了有力证据。
部分摘录
PAEs常见化学成分的获取
本研究通过PubMed、Google Scholar等数据库获取了常见PAEs的化学成分信息。具体搜索策略使用了“Phthalates”和“Chemical composition”等关键词，最终确定了PAEs的七种最常见化学成分：邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二异丁酯（DiBP）、邻苯二甲酸二丁基酯（DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）和邻苯二甲酸二异壬基酯（DiNP）。
PAE暴露下子宫内膜异位症中差异表达的FRGs的鉴定
本研究的工作流程图如图1所示。首先从ChEMBL、CTD、SwissTargetPrediction和PharmMapper中检索到5,325个PAE靶点，从GeneCards、OMIM、TTD和DrugBank中获取到2,440个子宫内膜异位症（EM）靶点。这些数据集的交集得到了929个预测的PAE-EM靶点（图2A）。相关数据库的详细信息见表S8。然而，这些预测的PAE-EM靶点仍需通过多组学方法进一步验证，以确保其对子宫内膜异位症的影响。
PAE暴露与子宫内膜异位症风险关联的当前研究进展
子宫内膜异位症（EM）是一种在育龄妇女中常见的慢性炎症性疾病，其特征是子宫内膜组织在子宫腔外异常植入和生长[62]、[63]。重要的是，邻苯二甲酸盐（PAEs）作为典型的环境内分泌干扰物，在塑料制造、化妆品和食品包装中广泛使用。它们可通过饮食摄入、皮肤接触和吸入轻易进入并积累在人体内，导致结论
总之，本研究确定ARF6是PAE暴露下的关键FRG，并展示了其在多个维度上对子宫内膜异位症的重要性。我们构建了一个“腔内细胞+纤毛细胞→成纤维细胞”的EM模型，将EM研究的焦点从“混合细胞”转向“特定亚型细胞”。最后，通过整合PAEs与子宫内膜异位症的关系网络，提出了“PAEs-铁死亡-EMT-子宫内膜异位症”轴心，并揭示了ARF6在其中的作用，转变了对该疾病的环境理解。
环境影响
邻苯二甲酸盐（PAEs）作为广泛使用的工业增塑剂，由于与聚合物的结合不稳定，容易渗入空气、水和土壤，并通过饮食摄入、吸入和皮肤接触进入人体，造成广泛的生殖暴露风险。本研究揭示了PAEs通过“PAEs - 铁死亡 - EMT - 子宫内膜异位症”轴心引发子宫内膜异位症，并构建了“上皮细胞（腔内细胞+纤毛细胞）→间充质细胞（成纤维细胞）”的EM模型。缩写
PAEs：邻苯二甲酸盐；EM：子宫内膜异位症；FRG：铁死亡相关基因；ARF6：ADP-核糖化因子6；EMT：上皮-间充质转化；scRNA-seq：单细胞RNA测序；DEGs：差异表达基因；WGCNA：加权基因共表达网络分析；GO：基因本体论；KEGG：京都基因与基因组百科全书；LASSO：最小绝对收缩和选择算子；RF：随机森林；XGBoost：极端梯度提升；ssGSEA：单样本基因集富集分析；
CRediT作者贡献声明
顾宁：写作——审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金筹集。朱玉敏：写作——审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、方法学研究、调查、资金筹集。王海阳：数据可视化、软件应用、方法学研究、数据管理、概念构思。吴凤萍：数据验证、调查、数据分析。李一凡：资源管理、调查、数据管理。陈海燕：数据可视化、验证利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（82103870）、中央高校基本科研业务费（14380541）、安徽省转化医学研究院重点项目（2022zhyx-B06）以及安徽省自然科学基金（2108085QH360）的支持。我们衷心感谢南京心血管信息与健康工程医学重点实验室（由南京市卫生健康委员会资助）的联合支持。
