布洛芬（Buprofezin）会导致白腿虾（Litopenaeus vannamei）的外骨骼缺陷：从机械性能到分子机制的研究

《Journal of Hazardous Materials》：Buprofezin induces exoskeletal defects in the whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei: from mechanical properties to molecular mechanisms

本研究评估了环境相关浓度Buprofezin对白leg虾外骨骼力学性能的影响，发现其显著降低外骨骼刚性和硬度，机制涉及壳质合成受阻、钙沉积减少及蜕壳相关生理过程紊乱，并揭示BPFN通过抑制氨基酸糖代谢和TGF-β/BMP信号通路干扰外骨骼形成。

　　

Conghui Shan|Chenxin Gong|Yingying Yu|Weixia Zhang|Difei Tong|Kaiwen Hu|Yan Gao|Yang Shu|Xunyi Zhang|Guangxu Liu|Wei Shi

浙江大学动物科学学院，杭州，310058，中国

摘要

布普罗芬（BPFN）是一种抑制节肢动物几丁质合成的杀虫剂，在农业中得到广泛应用，并且在水生环境中也越来越频繁地被检测到。由于几丁质合成途径的进化保守性，其对非目标甲壳类动物的潜在影响仍知之甚少。在这项研究中，我们探讨了与环境相关的BPFN浓度对白腿虾（Litopenaeus vannamei）外骨骼性质的影响。纳米压痕实验显示，暴露于BPFN后，外骨骼的刚度和硬度显著降低。同时，几丁质和总钙含量也下降，组织学和微CT成像显示矿化密度和角质层体积也有所减少。这些结构损伤与蜕皮相关的生理和生化指标的变化密切相关，包括糖原储存、几丁质酶活性、碳酸酐酶活性以及Ca²⁺动态的变化，这些变化与类固醇相关代谢途径有关。整合转录组学和代谢组学分析进一步表明，BPFN显著抑制了氨基糖和核苷酸糖的代谢，下调了几丁质前体生成所需的关键酶。BPFN还干扰了细胞外基质-受体相互作用和内质网相关蛋白的加工，破坏了角质层蛋白的组装，并扰乱了对碳酸钙沉积至关重要的TGF-β/BMP信号通路。综上所述，我们的研究结果表明，BPFN通过抑制几丁质合成和循环利用、干扰角质层蛋白加工、削弱碳酸钙矿化以及破坏与蜕皮相关的生理过程，损害了白腿虾外骨骼的结构完整性和机械性能。

引言

节肢动物（包括昆虫、甲壳类动物、螯肢动物和多足动物）的外骨骼是它们生存、生长和适应环境的关键进化适应性特征。[1] 这种复杂的结构不仅提供了机械强度和保护作用，还充当了抵御捕食、干燥和物理损伤等环境压力的屏障。[2] 在水生甲壳类动物中，外骨骼的机械完整性对其个体适应性、逃避捕食者以及蜕皮后的存活至关重要，从而影响种群稳定性和生态系统动态。[3] 此外，外骨骼强度的下降与死亡率升高、疾病易感性增加以及水产养殖系统的经济损失密切相关。[3] 外骨骼的形成和维持涉及多种生化过程，包括几丁质合成、蛋白质交联、矿物质沉积（例如碳酸钙[CaCO₃）以及随后的外骨骼硬化。[4] 这些过程受到严格调控，对维持外骨骼的结构完整性和功能至关重要。[5]

节肢动物的一个关键特征是蜕皮，这是一个周期性过程，在此过程中旧的外骨骼被脱落并形成新的外骨骼。[6] 对于甲壳类动物来说，这一过程尤为重要，因为它们在整个生命周期中必须经历多次蜕皮以适应身体生长并保持外骨骼的功能完整性。几丁质的生物合成是蜕皮的核心，它是构成外骨骼的基本骨架。[7] 任何几丁质合成的中断都可能干扰外骨骼的形成，延迟或阻止蜕皮，最终危及生存。[8],[9] 由于脊椎动物和维管植物缺乏几丁质，几丁质合成途径长期以来一直被认为是选择性杀虫剂开发的理想靶点。[10] 在干扰几丁质合成的昆虫生长调节剂（IGRs）中，布普罗芬（BPFN）已成为控制吸汁害虫最常用的制剂之一。[11] BPFN主要通过抑制几丁质形成和角质层沉积来阻碍蜕皮过程，从而干扰正常发育。暴露于BPFN的昆虫通常表现出蜕皮延迟、外骨骼脆弱或未完全形成、形态畸形，最终导致蜕皮失败。尽管传统上被归类为几丁质合成抑制剂，但越来越多的证据表明BPFN还干扰了与蜕皮相关的内分泌调节，特别是20-羟基蜕皮酮（20E）信号级联反应，这可能加剧其对几丁质代谢的抑制作用，导致蜕皮和发育的进一步损伤。[12]

自20世纪80年代引入以来，BPFN因其在控制害虫种群方面的高效性而在农业中得到广泛应用。[13],[14] 然而，其大规模的应用也使其通过农业径流、喷雾漂移和地下水渗漏等方式进入周围陆地和水生环境。[15] 因此，BPFN现在成为水体中最常检测到的杀虫剂之一。[11] 环境监测项目记录，在受污染严重的湖泊中，BPFN浓度高达3.5μg/L，在接收农业排放物的河流系统中为0.73μg/L。[16],[17] 在农药使用密集的地区，农业排水水中检测到BPFN残留量高达数十μg/L，[18] 这表明可能存在局部污染热点，超过典型背景水平。

此外，BPFN在水生环境中的半衰期相对较长，通常为几周到几个月，这促进了其持续存在和逐渐积累，从而带来持续的生态风险。越来越多的证据表明，水中的BPFN会对各种水生生物的多种生理过程产生不利影响，如胚胎发育毒性、组织病理学改变、氧化应激和炎症反应。[11],[19],[20],[21] 到目前为止，关于BPFN的研究主要集中在目标害虫物种上，对其对非目标甲壳类动物的影响了解甚少。现有的研究主要依赖于传统的毒理学指标（如死亡率和生长情况），这些指标无法充分揭示慢性或低水平暴露引起的亚致死性功能损伤。

白腿虾（Litopenaeus vannamei）是全球养殖最广泛的甲壳类物种之一，由于其对广泛盐度范围的显著适应性，2022年的全球产量达到了约680万吨。[22] 这种生态和生理适应性得益于其外骨骼的有效形成和维持，使其能够在多种养殖条件下支持生长、蜕皮和环境适应。这些特性促进了其在新兴农业-水产养殖模式中的应用，如“基于渔业的碱度控制”和各种“综合农业-水产养殖”系统。[23],[24],[25],[26] 然而，虾塘与农业用地之间的紧密空间耦合也增加了农药进入水产养殖环境的可能性。包括BPFN在内的农药可以通过径流、大气沉降和地下水渗漏进入水产养殖水体。[27],[28],[29]

白腿虾（L. vannamei）的外骨骼是一种矿化的纳米复合材料，由几丁质纤维、结构蛋白基质和CaCO₃组成。[30] 在其生命周期中，L. vannamei会经历近50次蜕皮，这一过程对外骨骼的更新和适当矿化至关重要。[31] 由于蜕皮控制着外骨骼的形成和机械完整性，任何干扰这一过程的环境因素都可能改变外骨骼的性质（例如模量和硬度），从而削弱其保护功能和整体适应性。[32],[33],[34],[35],[36] 例如，研究表明，接触干扰几丁质合成的杀虫剂teflubenzuron会破坏岩石池虾（Palaemon elegans）中与蜕皮和角质层相关的基因表达，但未评估这些分子扰动如何转化为结构完整性的变化。[37] 鉴于几丁质合成和蜕皮调节在包括甲壳类动物在内的所有节肢动物中都是保守的，理论上BPFN暴露可能同样会干扰L. vannamei的蜕皮生理和外骨骼形成。[33],[38] 然而，尽管在虾养殖集中的地区广泛使用BPFN，其对L. vannamei外骨骼形成和整体健康的影响仍不甚清楚。

因此，本研究旨在评估BPFN对L. vannamei外骨骼机械性能（如弹性模量和硬度）的影响。此外，通过以下关键生理过程研究了其背后的机制：(i) 通过量化外骨骼中的几丁质含量、测量己糖激酶（HK）活性、使用苏木精-伊红（HE）染色检查结构变化以及结合能量分散X射线光谱（SEM-EDS）分析元素组成来评估几丁质-蛋白基质的破坏；(ii) 通过X射线微计算机断层扫描（micro-CT）测量矿化密度并使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）量化总钙含量来表征CaCO₃矿化的损伤；(iii) 通过跟踪蜕皮过程中糖原含量、几丁质酶活性、碳酸酐酶（CA）活性和Ca²⁺水平的变化来评估蜕皮阶段的协调性紊乱。此外，还进行了整合转录组学和代谢组学分析，以阐明与外骨骼生物力学变化相关的分子途径。

动物和化学物质

实验所用白腿虾（L. vannamei）（3个月大，体长：12.37 ± 0.78厘米；体重：18.97 ± 2.42克）来自中国浙江海洋研究所。暴露前，虾在含有1500升过滤海水的2000升水箱中适应14天（温度28.4 ± 0.7 °C，pH 8.00 ± 0.06，溶解氧6.23 ± 0.17 mg/L，盐度20.5 ± 0.7 ppt，自然光照周期和持续通气）。每天两次（8:00和18:00）喂食商业饲料。

BPFN对外骨骼机械性能的影响

BPFN暴露显著降低了外骨骼的弹性模量和硬度（图1）。低浓度和高浓度BPFN组的头胸甲模量分别降至对照组的41.31%（3.59 ± 1.05 GPa）和46.37%（4.03 ± 0.93 GPa）（图1B，F_2,24 = 73.61，p < 0.01），两种处理组的值均显著低于对照组。同样，低浓度和高浓度BPFN组的腹部模量分别降至83.3%（6.66 ± 0.80 GPa）和34.6%（2.77 ± 1.07 GPa）。

讨论

农药的密集和广泛使用导致其在水生生态系统中的持续积累，引发了对其生态风险的日益关注。[49],[50] 本研究提供了首次实验证据，证明BPFN暴露会显著损害L. vannamei外骨骼的机械性能，显著降低其刚度和硬度。这种恶化预计会增加变形和微裂纹产生的风险。

结论

总之，本研究表明，BPFN通过抑制几丁质合成和循环利用、干扰角质层蛋白加工、削弱碳酸钙矿化，损害了L. vannamei的外骨骼形成。尽管我们的研究结果表明BPFN对甲壳类动物外骨骼的形成有不利影响，但需要进一步采用特定阶段和环境相关的暴露设计来进行研究，以阐明其影响。

环境影响

甲壳类动物的外骨骼对其生存、生长和适应环境挑战至关重要。尽管BPFN在水生生态系统中的存在普遍，但其对外骨骼的影响仍不清楚。我们的研究表明，BPFN暴露通过干扰几丁质代谢、蛋白质加工、矿化和与蜕皮相关的生理过程，损害了虾外骨骼的结构完整性和机械性能。

未引用参考文献

[91]

CRediT作者贡献声明

Wei Shi：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，项目管理，资金获取。Guangxu Liu：撰写 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取。Chenxin Gong：项目管理，方法学，研究，数据管理。Conghui Shan：撰写 – 原稿，可视化，软件，方法学，数据管理，概念化。Yan Gao：资源获取，研究，数据管理。Kaiwen Hu：研究，正式分析，数据

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFD2401001）、浙江省重大农业品种培育科技项目（2021C02069–5）以及中国国家自然科学基金（42306220 & 32172944）的支持。