《Journal of Inorganic Biochemistry》：Mutation of Pro76 affects the dynamics of Ω-loop D of yeast Iso-1-cytochrome
c: Application of gated Electron transfer
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细胞色素c的Ω环D中Pro76对构象稳定性和过氧化酶活性的调控机制。通过引入His和突变体（A72H76、A72H73G76、A72H73G76A79），结合pH滴定、GdnHCl unfolding及动力学研究，发现Pro76对维持天然构象至关重要，其突变显著 destabilizes天然状态并影响构象转换。
斯瓦蒂·班迪（Swati Bandi）| 布鲁斯·E·鲍勒（Bruce E. Bowler）
美国蒙大拿大学化学与生物化学系，密苏拉，MT 59812
摘要
细胞色素c（Cytc）包含两个Ω环（C环，残基40–57；D环，残基70–85），这些环控制着Cytc转变为具有过氧化物酶活性的酶所需的交替构象的途径。作为过氧化物酶，Cytc能够氧化线粒体脂质心磷脂，这是细胞凋亡过程中的一个早期信号。我们研究了Ω环D中高度保守的Pro76残基在控制Cytc交替构象形成中的作用。我们向Ω环D中引入组氨酸作为碱性构象转变的特异性探针。在K72A突变（A72H76变体）存在的情况下，我们将Pro76替换为组氨酸。我们还制备了具有K73H和P76G突变（A72H73G76）以及添加了K79A突变（A72H73G76A79）的变体。在可见光区域进行的pH滴定实验表明，与之前研究的K73H变体不同，A72H73G76和A72H73G76A79变体的Cytc在pH 2到11之间不会出现天然构象（Met80配位）。这表明P76G突变显著破坏了天然构象。A72H76变体在pH接近5时完全呈现天然构象。通过GdnHCl展开实验以及pH跳变和门控电子转移动力学研究，我们构建了A72H76变体的能量图谱。与其他Ω环D组氨酸变体的比较显示，P76H突变显著破坏了天然构象，而Pro76有助于形成类似天然的过渡态。这两个观察结果都表明Pro76对于控制过氧化物酶活性所需的交替构象的形成至关重要。
引言
细胞色素c（Cytc）最初因其在线粒体电子传递链中的作用而被研究，它作为电子从细胞色素还原酶传递到细胞色素c氧化酶的通道[1]、[2]。在过去的三十年中，Cytc的生物学功能不断扩展，包括清除活性氧、在程序性细胞死亡（凋亡）途径中的信号传导，以及最近在DNA断裂后调节染色质动态[3]。Cytc最初被鉴定为在细胞质中与Apaf-1（凋亡蛋白酶激活因子1）相互作用时促进凋亡小体形成的因子，从而激活caspase-8并引发凋亡[4]。后来发现，在凋亡的早期阶段，Cytc作为过氧化物酶氧化线粒体膜脂质心磷脂[5]。氧化后的心磷脂有助于Cytc释放到细胞质中[5]。
这种新的功能引起了广泛关注，因为它要求Cytc从一种具有饱和血红素铁配位结构的电子转移蛋白转变为一种需要铁原子开放配位位点的酶。由于两个表面环——Ω环C（残基40–57）和Ω环D（残基70–85）是Cytc中最不稳定的部分[6]、[7]、[8]，并且Ω环D为血红素提供Met80配体，因此这些环成为研究Cytc如何转变为酶的关键。长期以来，人们一直对Ω环C和D感兴趣，因为它们都参与了一种称为碱性构象转变的著名构象变化[10]、[11]。在碱性构象转变过程中，天然状态的血红素配体Met80被Ω环D中的Lys73或Lys79取代[12]、[13]，中点pH值通常在8.5到10之间[2]、[10]、[14]。通过突变诱导碱性转变的中点变化来测量Ω环D的稳定性，可以使用天然状态下的赖氨酸配体（位于73和79位）[15]，或者用组氨酸替换其中一个赖氨酸的变体[16]。因此，碱性构象转变提供了一种简便的方法来评估Cytc的突变是否增加了或减少了向过氧化物酶活性所需交替构象的转化。
许多研究集中在Ω环C上，因为几种自然存在的人类变异体（导致轻度血小板疾病——血小板减少症4型THC4）就发生在这一环上[17]、[18]、[19]。这些变异体会破坏两个Ω环，并增加Cytc的过氧化物酶活性[20]、[21]、[22]、[23]。这些变异体可能扰乱了稳定Met80-血红素键的氢键网络[24]、[25]。
Ω环D也被证明会改变Cytc的Met80-血红素配位稳定性和过氧化物酶活性[24]、[26]。Ω环D高度保守（图1A），这表明它已经高度进化，以使Cytc能够执行其多种功能。只有81、83和85位发生了显著变化。从低等真核生物到高等真核生物（包括人类），81位从Ala变为Val再变为Ile，体积逐渐增大。在人类Cytc中，I81A突变会破坏Met80-血红素构象并增加过氧化物酶活性[26]。在酵母iso-1-Cytc中，将Ala81替换为体积较大的组氨酸可以减缓Ω环D的动态[27]。因此，这个位置的体积较大的残基似乎有助于稳定血红素-Met80配位。我们还尝试通过将Gly83替换为Ala和Pro来稳定Ω环D[28]。使用K73H突变研究的G83P突变相对于His73-血红素碱性构象略微稳定了天然状态，但过氧化物酶活性有所下降。然而，过氧化物酶活性的下降似乎主要是由于His73作为血红素配体的可用性[28]。
Pro76是严格保守的。使用酵母iso-2-Cytc的研究表明，P76G突变显著降低了iso-2-Cytc天然构象的稳定性，相对于未折叠状态和碱性构象（其中Met80被Ω环D中的Lys73或Lys79取代）[32]、[33]。对于酵母iso-1-Cytc，P76A突变显著降低了天然构象的稳定性，相对于碱性构象（表观pK_a降低了约1个单位），但对整体稳定性只有轻微影响[34]。为了进一步研究Pro76在控制Ω环D稳定性中的重要性，我们制备了一系列酵母iso-1-Cytc变体，以探究这一残基对打破血红素-Met80键所需Cytc动态的影响。所有变体都采用了我们开发的一种策略，即向Ω环D中引入组氨酸，从而使His-血红素碱性构象形成。His-血红素碱性构象的形成动力学明显快于自然观察到的Lys-血红素碱性构象，因此在动力学研究中容易将其区分开来[35]。我们过去曾使用这种策略来监测Ω环D不同部分的动态差异。特别是，我们观察到His73介导的碱性构象转变与三个可电离基团有关[35]、[36]、[37]、[38]。另一方面，当His位于79或81位，或者在His73存在的情况下将三甲胺赖氨酸（Tml）72突变为Ala时，只需要两个可电离基团就可以解释碱性转变的动力学[27]、[39]、[40]、[41]。在这里，我们展示了A72H76变体（K72A/P76H，图1B）的数据，以便直接监测这一位置Ω环D的动态以及用组氨酸替换空间受限的Pro氨基酸的效果。这种变体旨在直接探究Ω环D在76位的灵活性。
我们还制备了另外两种变体A72H73P76（K72A/K73H/P76G）和A72H73P76A79（K72A/K73H/P76G/K79A）。这些变体形成了经过充分研究的His73碱性构象，其中Pro76被替换为构象上最灵活的氨基酸甘氨酸，这与之前在iso-2-Cytc中的研究类似[32]。
我们提供了所有三种变体的全局稳定性数据以及pH滴定数据，以监测pH 2到11之间血红素配位的变化。最后，通过pH跳变和门控电子转移方法研究了A72H76变体的碱性转变动力学，从而仔细评估了Ω环D在76位的动态以及P76H突变对iso-1-Cytc天然构象和碱性构象稳定性的影响。
片段
定向突变
所有变体都是使用pRbs_BTR1载体生产的[42]，该载体是pBTR1载体[43]、[44]的衍生物，具有优化的核糖体结合位点[45]。pRbs_BTR1载体携带酵母iso-1-Cytc的CYC1基因和编码酵母血红素裂解酶的CYC3基因，使得血红素能够与无辅基细胞色素c在大肠杆菌的细胞质中共价结合[43]。在本研究中生产的所有变体中，用于定向突变的pRbs_BTR1载体都携带了伪野生型（pseudoWT）
酵母iso-1-Cytc变体的稳定性
通过GdnHCl变性在pH 7.5下监测了A72H76、A72H73G76和A72H73G76A79变体的全局展开情况。图3显示了校正后的椭圆率（θ222corr）与GdnHCl浓度的关系图。从方程式1对数据拟合得到的热力学参数ΔG_u^o'(H2O)和变性剂m值见表1。A72H76变体是三种变体中最不稳定的，其ΔG_u^o'(H2O)值比其他两种变体低约1 kcal/mol
A72H76、A72H73G76和A72H73G76A79变体的pH滴定行为比较
在比较A72H76、A72H73G76和A72H73G76A79变体时，几个特征在pH变化对血红素配位的影响方面非常突出。首先，在低pH区域，值得注意的是，A72H76变体中的Met80（pKa1 = 3.74，在695 nm处，表S3）能够在比A72H73G76和A72H73G76A79变体（pKa2约为5，表S3）更低的pH下保持作为血红素配体。这部分可能反映了Gly76对Ω环D的破坏作用大于His76。
结论
在本研究中，我们结合了将组氨酸引入Ω环D的方法和门控电子转移技术，对Pro76在Cytc功能特性中的作用进行了详细分析。当Ω环D中的Lys73突变为组氨酸时，Pro76突变为甘氨酸会阻止iso-1-Cytc在pH 2到11之间的任何pH下呈现天然构象。这些结果与之前关于P76A iso-1-Cytc[34]和P76G iso-2-Cytc[32]的研究一致，这些研究表明pKa值的变化
CRediT作者贡献声明
斯瓦蒂·班迪（Swati Bandi）：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，实验研究，形式分析。
布鲁斯·E·鲍勒（Bruce E. Bowler）：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取，形式分析，概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我要感谢Tim Storr邀请我为纪念Chris Orvig从不列颠哥伦比亚大学退休的特刊贡献一篇文章。这项工作得到了NSF[CHE-0650156]和[CHE-1904895](B.E.B.)的资助。
