《Drug Delivery and Translational Research》：Nano-antimicrobial peptides (Nano-AMPs) to combat resistant gram-negative bacteria
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这篇综述探讨了纳米抗菌肽（Nano-AMPs）作为应对全球抗菌素耐药性（AMR）危机的创新疗法。它分析了多种纳米载体（如脂质体、聚合物、无机纳米颗粒）在提升抗菌肽（AMPs）稳定性、靶向递送、生物利用度和安全性方面的潜力，并重点阐述了其对抗多重耐药（MDR）革兰氏阴性病原体的协同效应与独特机制。文中也展望了结合人工智能（AI）进行肽与载体设计，以加速下一代抗生素开发的未来方向。
引言
抗菌素耐药性（AMR），特别是针对革兰氏阴性病原体的耐药性，已成为全球公共卫生的重大威胁。世界卫生组织（WHO）已将AMR列为全球健康优先事项，预计到2050年，AMR每年将导致1000万人死亡，其中革兰氏阴性菌是这场危机的关键贡献者。多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）菌株的出现导致可用治疗方案稀缺，增加了发病率和死亡率。尽管努力开发新抗生素，研发管线仍然有限，迫切需要替代治疗策略。
在此背景下，抗菌肽（AMPs）作为先天免疫系统的重要组成部分，因其广谱杀菌和免疫调节特性，以及独特的作用机制（如膜破坏、孔道形成和免疫调节），已成为传统抗生素有前途的替代品。然而，AMPs的临床转化面临诸多挑战，包括酶和非酶降解、生物利用度差、生物相容性问题以及局部和全身不良事件。为了应对这些问题，纳米载体递送系统的最新进展提供了新颖的解决方案。
革兰氏阴性菌的双膜结构为传统药物设置了屏障
革兰氏阴性菌，如鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌，其出现多重耐药性加剧了全球AMR危机。这些病原体通常具有耐药性，源于其复杂的细胞结构、膜通透性降低、抗生素降解、外排泵和孔蛋白的存在，以及通过水平基因转移（HGT）获得耐药基因的能力。革兰氏阴性菌独特的外膜结构，其外叶含有脂多糖（LPS），可作为带正电荷的AMPs和疏水性药物渗透的屏障。孔蛋白是嵌入外膜的蛋白质通道，调节包括抗生素在内的小分子进入。细菌可以改变孔蛋白结构或下调其表达以限制抗生素摄取。此外，革兰氏阴性菌的固有耐药基因可编码构成外排泵或降解抗生素的蛋白质。外排泵主动将抗生素和其他有毒物质排出细菌细胞，从而降低细胞内药物浓度并使抗生素失效。革兰氏阴性菌还能产生可修饰或降解抗生素的酶，例如水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶。克服这些挑战需要创新策略，例如纳米抗菌肽（Nano-AMPs），以有效靶向并规避其耐药机制。
AMPs的作用机制
AMPs是天然或合成的分子，通常带正电荷且具有两亲性，可以选择性地与带负电荷的细菌膜结合，导致孔道形成、膜透化以及微生物裂解。某些AMPs可穿透细菌膜并靶向细胞内成分，如蛋白质、RNA或DNA，从而破坏关键的细胞功能。例如，LL-37和吲哚西丁已知可与细菌DNA结合。一旦进入细胞内，AMPs可以抑制对细菌代谢至关重要的酶，从而导致细胞功能障碍。
革兰氏阴性菌外膜中存在的带负电荷的脂多糖（LPS）会吸引带正电荷的AMPs，后者可以通过插入膜内形成跨膜孔来破坏膜（桶板模型；图2a），或者也可以通过使膜围绕自身弯曲来创建孔（环形孔模型；图2b）。此外，这个过程可以通过像“地毯”一样覆盖膜并通过胶束形成来破坏膜的完整性（地毯模型；图2c）。这些破坏性方法可导致膜电位丧失或细胞内含物泄漏，最终导致细菌细胞死亡。
许多AMPs以无活性的前体形式存在，通常需要蛋白酶等酶加工才能激活。AMPs在适应性免疫系统激活之前，作为抵御入侵病原体的第一道防线。细菌感染可诱导蛋白酶体组成和功能的变化，包括蛋白酶体激活因子亚基3（PSME3）的募集，从而增加切割并增强杀菌活性。
纳米载体作为替代性药物递送系统
AMPs是先天免疫系统的一部分，通常由10-100个氨基酸组成，具有两亲性和阳离子电荷的特性，使其能够与带负电的微生物膜相互作用。虽然AMPs具有许多重要特性，例如细菌难以对其产生耐药性，但其临床应用受到阻碍，因为它们容易在体内被蛋白酶酶促降解、血清结合和快速系统清除。较高浓度的AMPs可能引起宿主细胞毒性，尤其是在敏感组织中。此外，大规模化学合成AMPs成本高昂，构成了商业化的障碍。
将AMPs纳入纳米载体对于解决游离AMPs相关的局限性至关重要，例如较差的药代动力学和药效学特征，特别是在多重耐药革兰氏阴性病原体的背景下。纳米载体可以保护AMPs免受酶和非酶降解，促进其与微生物细胞的特异性相互作用，从而增加抗菌活性并限制脱靶效应。此外，它们可能具有免疫调节特性，促进免疫细胞募集并有利于细胞因子产生，从而增强其治疗潜力。
改善感染部位的生物利用度
纳米载体可以通过解决关键的药理学挑战来提高AMPs在感染部位的生物利用度，例如促进AMPs的控制释放，在较长时间内维持治疗浓度，从而延长循环半衰期。纳米AMPs有利于AMPs在感染部位的吸收和滞留，从而减少给药频率。纳米系统，如固体脂质纳米粒（SLNs）、脂质和聚合物纳米颗粒，可用于通过将AMPs封装在生物相容性基质中来避免酶降解，从而延长其系统循环并实现感染部位的持续释放。例如，将多粘菌素B封装在脂质纳米粒中可以降低肾毒性事件，并将血浆半衰期从2小时增加到8小时，同时在铜绿假单胞菌感染中将肺部蓄积增加三倍。
在感染的大鼠肺部感染模型中，封装多粘菌素B的脂质纳米粒显示出持续的药物水平和更高的肺组织浓度，对铜绿假单胞菌具有显著的细菌清除作用，并保护药物免受快速系统清除，从而使AMPs集中在感染部位。在小鼠肺炎模型中，将多粘菌素B封装在脂质纳米粒内增加了药物在肺上皮内的滞留和暴露时间，使得在较小剂量下即可实现有效的微生物杀灭，这确立了脂质纳米载体作为增强局部AMP生物利用度的强大策略，特别是在肺部感染中。
选择性和靶向递送
纳米载体可以递送AMPs穿过革兰氏阴性菌的外膜，绕过脂多糖（LPS）带来的挑战。功能化纳米颗粒可以特异性与微生物膜成分相互作用，增强细胞结合和摄取。它们可以使用靶向配体进行优化，例如抗体和可识别的细菌特异性受体，从而实现精准递送。肽两亲物在与肝素结合cardin-motif肽功能化时发生自组装，通过破坏其外膜组织导致细胞质泄漏来对抗耐药病原体。
用壳聚糖涂覆的超顺磁性氧化铁工程纳米颗粒形成生物共轭物，能够实现AMPs的共价固定，保持其结构完整性，并对致病性大肠杆菌（O157:H7）显示出增强的杀菌活性，表明肽-病原体相互作用的潜力。此外，SPION核心由于磁铁矿结构表现出超顺磁性，支持外部操作，突出了它们在感染部位进行磁引导靶向药物递送的潜力。
用硒化镉（CdSe）功能化的纳米AMPs显示出更好的抗菌活性，在体外可杀死>98%的多重耐药大肠杆菌群体，并在体内实现显著的微生物清除，这是由于肽的水溶性增强，有利于稳定性，并具有更强的膜破坏特性。此外，血液学和病理组织学分析表明，量子点纳米载体通过减少脱靶效应，最大限度地降低了系统毒性。因此，纳米AMP可以被设计用于递送高效、低毒性的抗革兰氏阴性病原体的抗菌剂。
增强的疗效和安全性
金属纳米颗粒显示出固有的抗菌特性，因为它们可以产生活性氧（ROS）、破坏微生物膜、干扰蛋白质功能并损害DNA复制。将AMPs纳入金属纳米载体可以放大杀菌效果并有利于协同相互作用。用配体功能化的金属纳米颗粒可以通过内吞作用改善其细胞摄取，使其能够到达细胞内病原体。刺激响应性纳米载体确保AMPs仅在感染部位活跃，例如pH敏感的AMP偶联物在酸性环境中释放蜂毒肽，防止全身细胞毒性不良事件。
金纳米颗粒-DNA适配体有利于AMP偶联物的腹腔递送，在感染多重耐药鲍曼不动杆菌的小鼠中，显示出更好的生存结果，并且主要器官中的细菌载量显著降低。靶向纳米载体药物递送在病原体特异性蓄积和肽稳定性方面优于单独的适配体-纳米颗粒或游离AMPs，证明适配体引导的AMP纳米载体可以在体内对未治疗的革兰氏阴性感染实现更好的治疗效果和安全性，强调了纳米AMPs针对多重耐药病原体的转化精确性。
用半胱氨酸残基AMPs标记的银纳米颗粒形成生物共轭物，并增强了对多重耐药病原体的效力，特别是对肺炎克雷伯菌，其MIC比游离肽低3-10倍。机制方法和分子动力学表明，纳米颗粒偶联物优化了微生物膜结合和孔道形成，这是由疏水塌陷方法介导的。半胱氨酸引导的组装通过降低其治疗剂量减轻了生物相容性纳米结构的毒性风险，突出表明纳米AMPs可以实现更高的杀菌效果和增强的安全性，并为药物递送方法提供了比传统抗生素新颖的替代方案。
有限的宿主细胞毒性
纳米AMPs可以防止与宿主细胞膜的非特异性相互作用，从而降低宿主细胞毒性。功能化纳米载体，特别是结合了DNA、壳聚糖、纤维素或聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）的聚合物纳米系统，具有生物相容性和可生物降解性；因此，它们可用于将AMPs特异性递送至细菌细胞，最大限度地减少对宿主细胞的非特异性暴露，并提高其治疗指数。PLGA纳米颗粒保护AMPs免受酶降解，通过限制与非靶细胞的非特异性相互作用来降低细胞毒性，从而优化AMP向特定组织的转运，使其成为由铜绿假单胞菌引起的肺部感染的有效载体。
用AMPs功能化的金纳米棒在限制对红细胞和人类成纤维细胞的细胞毒性的同时，表现出更好的效力，与未偶联的金纳米棒相比，产生了更有利的治疗窗口。纳米棒-AMP偶联物在亚最佳纳米颗粒治疗剂量下实现了激光增强的杀菌效果，最大限度地减少了非特异性组织相互作用。在体内，它们通过加速伤口愈合证明了纳米棒-AMPs的生物相容性，突出表明表面功能化可用于将光热细胞毒性剂转化为相对更安全和有效的抗菌剂。
AMPs可以调节免疫反应；因此，纳米封装可以通过将AMPs与免疫细胞屏蔽来降低免疫原性反应的整体风险。例如，与蜂毒肽偶联的金纳米颗粒在小鼠败血症模型中显示大肠杆菌载量减少高达90%，这归因于其膜破坏和免疫调节的双重机制。结合AMPs的聚合物纳米颗粒在全身感染模型中显示出有希望的结果，其中持续的药物释放改善了药代动力学特征，从而在调节宿主炎症反应的同时提高了生存结果。
增强纳米AMPs选择性靶向的策略
纳米AMPs的选择性递送可能有益于对抗多重耐药感染。在感染部位，血管通透性增强、酶活性、pH值、氧化应激和免疫环境为靶向药物递送提供了机会。主动靶向策略包括可以与病原体或免疫细胞上存在的受体结合的配体，显著增强感染组织内的细胞摄取。被动靶向方法可以利用感染组织增强的通透性和渗漏，有利于纳米AMPs在感染部位的外渗和定位。表面修饰和阳离子性可以增强对带负电荷的细胞基质的渗透。
除了主动和被动靶向方法外，刺激响应性纳米载体已成为创新的药物递送系统，在病变微环境中释放AMPs。在感染部位，酸性pH、蛋白酶以及氧化还原梯度等因素可以触发从工程化脂质体、聚合物或树枝状聚合物中控制并持续释放AMPs。物理靶向方法，包括磁引导纳米颗粒，也可以改善药物的动力学。用外泌体或免疫细胞膜包被的仿生纳米载体可以逃避免疫清除，并在感染组织中停留更长时间。结合刺激响应性修饰以及宿主和病原体特异性配体可以最大化治疗潜力，同时最大限度地减少脱靶效应。
此外，整合机器学习和人工智能平台进行AMP发现和设计，可以促进AMP序列和纳米载体响应性的协同优化，从而加速针对耐药革兰氏阴性病原体的潜在可行纳米AMPs的临床转化。
纳米AMPs作为抗革兰氏阴性病原体的新型疗法
纳米载体可以通过靶向细菌膜显著提高AMPs的功效。它们的表面特性可以用靶向特异性细菌成分进行功能化，从而增加细胞内AMP的摄取，例如配体功能化的纳米颗粒结合细菌凝集素或孔蛋白以直接内化，从而克服革兰氏阴性菌外膜引起的一些内在耐药性。纳米颗粒，如金属纳米颗粒，可以独立地或与AMPs协同破坏细菌膜，从而放大微生物损伤，例如银纳米颗粒与AMPs结合，可以更有效地破坏外细菌膜的稳定性。
将AMPs纳入纳米颗粒中可能能够通过防止识别和外排来绕过抗生素外排泵，从而有利于直接细胞内递送。某些纳米载体可以将外排泵抑制剂与AMPs一起封装，确保微生物内更高的细胞内AMP滞留时间。在脂质基纳米系统中共封装抗菌佐剂可防止药物过早失活，融合特性有利于靶向递送，并具有增强的生物分布和药代动力学特征。
结论
纳米抗菌肽代表了一种有前景的策略，通过增强稳定性、靶向性和安全性，并规避传统耐药机制，来应对日益严重的抗菌素耐药性危机，特别是针对革兰氏阴性病原体。脂质、聚合物和无机纳米载体在临床前模型中显示出改善AMPs药代动力学和药效学的潜力。将人工智能和机器学习整合到AMP和纳米载体设计中，有望加速合理设计和临床转化。尽管在生产、长期安全性和监管批准方面仍存在挑战，但跨学科努力和持续研究对于释放纳米AMPs作为下一代抗感染疗法的全部潜力至关重要。
