《Chemistry & Biodiversity》：Phytochemical Variability of Mentha L. Species Over Three Growing Seasons
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本文对留兰香和胡椒薄荷进行了为期三年（2022-2024）的综合评估，通过光谱法、HPLC-DAD和GC-MS分析，系统比较了其总酚（TPC）、总黄酮（TFC）、抗氧化活性（AA）、单体酚及精油（EOs）含量。研究揭示了显著的种间与种内差异，并明确了基因型是影响植物化学特征的主要因素，而年份具有中等影响。这些结果凸显了特定薄荷物种在食品、医药和化妆品应用中的巨大潜力。
1 引言
自史前时代以来，草药和香料就在人类生活中扮演着至关重要的角色，尤其在传统医学中的应用。薄荷属植物（唇形科）广泛分布于欧洲、亚洲、非洲、澳大利亚和北美洲。其分类学十分复杂，包括大约42个物种和15个杂交种，以及众多的亚种和栽培品种。这种复杂性主要源于频繁的种内和种间杂交以及无性繁殖。一般认为，构成薄荷属的五个基本物种衍生出了11个自然发生并已命名的杂交种。
多种薄荷属植物因其广泛的生物活性而被频繁使用，包括抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒、抗过敏、抗炎、抗高血压和生物杀虫等效应。这些特性支持了其在制药、化妆品、食品、调味品、饮料和农业等多个领域的广泛应用。在薄荷属植物中，仅有四种被报道为商业栽培以获取其精油和牧草产量：留兰香、胡椒薄荷、柠檬薄荷和日本薄荷。印度是薄荷油的最大生产国、出口国和消费国，满足了约80%的国际需求，其次是美国和中国。薄荷的生物活性归因于其含有的生物活性植物化学物质，主要包括萜类、酚酸和黄酮类化合物。这些来源于植物次级代谢途径的代谢物，在不同的薄荷化学型和生态型中表现出极高的化学多样性。
薄荷的化学成分受多种因素影响，例如生长地点、土壤性质、温度、生命周期阶段、植物品种、生长、气候条件和收获时间。尽管存在这种变异性，但每个薄荷物种通常由一个特征性的主要化合物来定义。
留兰香（M. spicata）可新鲜、干燥、粉末或传统上作为草药茶使用。在民间医学中，它常用于治疗呼吸和消化系统问题。除了用于药物制剂外，它在香水、化妆品和食品工业中也具有重要意义。传统留兰香品种精油的挥发性特征主要由香芹酮构成，同时含有其他化合物，如柠檬烯、胡薄荷酮、胡椒酮等次要成分。相反，留兰香的极性提取物以高含量的酚类化合物为特征，如迷迭香酸、咖啡酸、对香豆酸、芹菜素、木犀草素和杨梅素。
胡椒薄荷（M. × piperita）是水生薄荷和留兰香的第一代杂交种，是最广泛消费的单一成分草药茶之一。其有益作用包括抗氧化和抗菌特性，以及对消化道的益处。作为食品、化妆品和制药工业生物活性化合物的最大潜在来源之一，它具有重要的经济意义。其精油是全球生产和销售最广泛的精油之一。估计超过50%的精油用于口香糖，约30%用于牙膏和其他口腔护理产品。作为胡椒薄荷精油主要成分的薄荷醇和薄荷酮的含量分布范围很广，分别为30%至60%和10%至30%。迷迭香酸、咖啡酸、没食子酸、芦丁、橙皮苷和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸被报道为薄荷提取物的主要酚类成分。
尽管薄荷的使用广泛，但对其他植物化学特征进行系统性多年比较的研究仍然缺乏。大多数先前的研究集中于单一季节或特定的化学型，仅提供了植物化学变异性的有限视角。然而，次级代谢物的积累受基因型以及环境条件（包括温度和降水的年际波动）的影响，这可能导致植物化学含量因生物合成活性的变化而产生差异。因此，一项为期三年的研究为评估物种特异性模式和季节变化的影响提供了更可靠的基础。基于此，本研究旨在表征2022-2024年间在捷克共和国栽培的两种薄荷属植物的化学组成。通过紫外/可见分光光度法测定总酚含量、总黄酮含量和DPPH自由基清除抗氧化活性，对提取物进行分析以比较其化学成分。通过HPLC-DAD鉴定和定量单体酚类化合物，而薄荷属植物精油的成分则通过GC-MS测定。通过主成分分析评估样品间的多变量关系。
2 结果与讨论
2.1 UV/Vis 测量
连续三年收集的薄荷甲醇提取物的总酚含量、总黄酮含量和抗氧化活性的结果总结于图1和附表S2。2022年，留兰香“2”记录了所有分析参数的最低水平，而胡椒薄荷“科维努斯大学”显示出最高值。2023年出现了不同的模式，留兰香“科维努斯大学”表现出最低的总酚含量、总黄酮含量和抗氧化活性值，而胡椒薄荷“珀耳塞福涅”在所有参数上达到最高水平。2024年，所有物种的测量参数均呈现明显上升，尤其是抗氧化活性。当年，留兰香“科维努斯大学”再次显示最低的总酚含量和总黄酮含量值，而胡椒薄荷“科维努斯大学”则表现出最高的总酚含量、总黄酮含量和抗氧化活性值。这些结果证明了明确的基因型差异和年份依赖性对酚类积累和抗氧化潜力的影响。
类似的结果先前已有报道。本研究中薄荷甲醇提取物的总酚含量、总黄酮含量和抗氧化活性值与已发表的数据相符。酒精提取物的这些值在其他地方已有研究，但数值差异显著。这可归因于提取溶剂、分析方案以及各种生物和非生物因素（如基因型、地理起源、土壤类型和栽培条件）的差异。
我们的结果符合这一模式，并进一步表明年际气候变异性在观察到的年际差异中发挥了重要作用。特别是，2024年异常高的总酚含量、总黄酮含量和抗氧化活性值，与一个以较高平均温度和增加降水为特征的季节相对应，已知这些条件能刺激唇形科植物中酚类的生物合成。这些结果表明，薄荷中次级代谢物的积累并非仅由基因型驱动，也在一定程度上受到生长季主要环境条件的调节。
2.2 HPLC–DAD 分析
通过HPLC-DAD共测定了13种酚类化合物，包括5种黄酮类化合物（芦丁、杨梅素、木犀草素、槲皮素和芹菜素）和8种酚类化合物（原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、阿魏酸、迷迭香酸和肉桂酸）。在薄荷样品间以及连续三年的栽培中，均观察到酚类化合物含量的显著变异性。迷迭香酸是所有样品中的主要化合物，浓度范围从留兰香“2”（2022年）的6227.11 ± 205.04 μg/g DW到胡椒薄荷“科维努斯大学”（2023年）的29320.70 ± 1026.75 μg/g DW。其他主要成分包括绿原酸、阿魏酸和芦丁，尽管它们的含量因基因型和年份不同而有很大差异。在黄酮谱中观察到明显的种间差异。特别是，木犀草素和槲皮素在留兰香中持续被检测到，平均浓度为12.35 ± 0.53 μg/g DW，而这些化合物在胡椒薄荷中不存在，除了2023年的胡椒薄荷“珀耳塞福涅”，其中检测到木犀草素为2.66 ± 0.13 μg/g DW。代表性HPLC-DAD色谱图见附图S2–S6。
观察到的酚类含量年际变异性部分归因于三个生长季气候条件的差异。2024年记录的迷迭香酸和绿原酸浓度升高，与该年记录的较高温度和降水水平相符，这些已知条件能刺激苯丙素途径的通量。尽管基因型仍然是酚类组成的主要决定因素，但环境因素似乎调节了各季节单个化合物的绝对浓度。
所获得的结果与先前的研究报告吻合良好。根据最近的综述，酚酸是薄荷属植物中最重要的活性化合物之一。
与之前的发现一致，尽管在样品间观察到显著的数量差异，但迷迭香酸在所有基因型和年份中始终是主导的酚类化合物。
2.3 精油得率与 GC–MS 表征
每个样品三次独立水蒸馏的平均精油得率见表2。精油得率范围从0.55%到2.31%（体积/重量），所有物种在2024年观察到最高得率。这些结果与先前报道的数据吻合良好。
精油组成，如同其他测量结果一样，也显示出显著差异。在薄荷精油中共鉴定出67种成分。为清晰起见，表3展示了含量超过1%的化合物，完整数据集见附表S3–S5。代表性样品的GC-MS色谱图见附图S7。大多数物质的丰度不仅在物种间存在差异，在胡椒薄荷的不同物种间也存在差异。各物种的主要成分鉴定如下：留兰香“2”-香芹酮（约68%），留兰香“科维努斯大学”-香芹酮（约65%），胡椒薄荷“佩尔佩塔”-薄荷酮（约58%），胡椒薄荷“科维努斯大学”-dl-薄荷醇（约50%），以及胡椒薄荷“珀耳塞福涅”-氧化胡椒烯酮（约67%）。所有物种主要化合物的含量在年份间的差异不显著。然而，其他化合物的含量在年份间存在差异；例如，胡椒薄荷“珀耳塞福涅”物种中，2023年至2024年间germacrene D的含量分别为：14.80% ± 0.82%、5.68% ± 3.33%和60.13% ± 2.75%。这表明某些物种对环境波动更为敏感，这与先前将精油组成与气候和土壤条件联系起来的报告一致。
