MsDUF3700通过SLY1介导的DELLA蛋白降解调控紫花苜蓿和拟南芥生长的分子机制解析

《Plant Physiology and Biochemistry》：MsDUF3700 regulates plant growth via SLY1-mediated DELLA degradation in alfalfa and Arabidopsis

本文报道了一项关于紫花苜蓿未知功能域（DUF）蛋白MsDUF3700在调节植物生长中的功能与机制研究。研究人员通过酵母双杂交筛选发现，MsDUF3700与F-box蛋白MsSLY1互作，形成复合物促进赤霉素（GA）信号通路中关键负调节因子DELLA蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。该工作揭示了MsDUF3700通过MsSLY1-DELLA调控模块促进茎秆伸长的新机制，为理解豆科植物生长调控机制及培育高生物量饲草品种提供了新靶点。

　　

植物高度是决定作物生物量积累和产量的核心农艺性状之一。在众多内源调节因子中，赤霉素（Gibberellins, GAs）是促进茎秆伸长和调控植物生长发育的关键激素。其信号传导通路的核心环节在于负调节因子DELLA蛋白的降解。当GA存在时，受体GA-INSENSITIVE DWARF1 (GID1)与DELLA蛋白结合，使其被SCF^SLY1(Skp1–Cullin–F-box) E3泛素连接酶复合体识别，进而通过泛素-蛋白酶体途径降解，从而解除DELLA对GA响应的抑制，促进植物生长。然而，在豆科作物，尤其是全球广泛种植的优质饲草——紫花苜蓿中，赤霉素信号通路的分子调控网络，特别是其中众多未知功能域（Domain of Unknown Function, DUF）蛋白的作用，仍有大量空白。

为了发掘调控紫花苜蓿株高的关键基因，中国农业大学的研究团队从一项全基因组关联分析（Genome-wide association study, GWAS）的候选基因入手，对一个编码DUF3700结构域蛋白的基因MsDUF3700进行了深入研究。他们发现，在紫花苜蓿中过表达MsDUF3700，能够显著增加植株高度、茎秆直径和地上部生物量。为了阐明其背后的分子机制，研究人员通过酵母双杂交筛选，鉴定出赤霉素信号通路中的关键F-box蛋白MsSLEEPY1 (MsSLY1) 是MsDUF3700的潜在互作伙伴。随后，通过双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）和免疫共沉淀（Co-IP）等多种体内外实验，证实了两者确实存在直接的物理互作。

研究人员进一步在模式植物拟南芥中验证了MsSLY1的功能，发现异位表达MsSLY1能够部分挽救sly1突变体的典型生长缺陷，包括子叶扩张受损和茎伸长减少。这证明了MsSLY1在功能上是保守的。更深入的生化分析表明，MsDUF3700-MsSLY1复合体能够促进DELLA蛋白通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。在拟南芥sly1突变体背景下过表达MsDUF3700，可以部分缓解其矮化表型，这支持了MsDUF3700依赖SLY1来调控植物生长的作用模式。此外，对MsDUF3700过表达植株的赤霉素含量和信号通路基因表达分析发现，多个GA生物合成中间体和关键合成基因（如MsKAO1/2, MsGA20ox4/5, MsGA3ox1）水平上调，而负责GA失活的MsGA2ox8和负调节因子MsDELLA的表达下调，受体MsGID1B和MsSLY1本身表达上调。这些结果共同表明，MsDUF3700通过协调调控GA的生物合成和信号传导，精细地优化了GA通路的输出，从而促进了紫花苜蓿茎秆的伸长和生物量积累。

这项题为“MsDUF3700 regulates plant growth via SLY1-mediated DELLA degradation in alfalfa and Arabidopsis”的研究论文发表在《Plant Physiology and Biochemistry》期刊上。它揭示了一个由DUF蛋白参与的、调控赤霉素信号通路的新模块，为理解豆科植物生长发育的遗传与分子机制提供了新见解，并鉴定出MsDUF3700作为改良紫花苜蓿株型和饲草产量的一个潜在靶点基因。

本研究采用的主要关键技术方法包括：1) 利用模式植物拟南芥及其sly1突变体进行功能互补和遗传互作分析；2) 酵母双杂交（Y2H）筛选与验证，用于鉴定蛋白互作；3) 双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）和免疫共沉淀（Co-IP）等体内外实验，用于确认蛋白间的物理互作；4) 无细胞降解实验，用于评估DELLA蛋白的稳定性；5) 超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术，用于测定内源赤霉素含量。

3.1. Overexpression of MsDUF3700enhances plant growth and stem development in alfalfa

研究人员对紫花苜蓿‘中苜1号’品种进行了遗传转化，获得了MsDUF3700过表达（MsDUF3700OE）转基因株系。与野生型相比，MsDUF3700OE植株表现出显著增加的株高、茎粗和地上部生物量。形态学和解剖学分析表明，其株高增加源于节间数目增多和节间长度伸长，茎粗增加则与髓腔增大、韧皮部组织扩张以及木质部细胞显著伸长有关。这些结果证明MsDUF3700能促进紫花苜蓿茎秆的纵向和径向生长。

3.2. MsDUF3700 physically interacts with the F-box protein MsSLY1

为了探究MsDUF3700的作用机制，研究人员以MsDUF3700为“诱饵”，进行了酵母双杂交筛选，从核cDNA文库中鉴定出36个潜在互作蛋白，其中包括一个与植物生长调控相关的F-box蛋白。系统发育和保守结构域分析表明，该蛋白与拟南芥赤霉素信号通路核心组分SLEEPY1 (SLY1)高度同源，因此将其命名为MsSLY1。随后的BiFC、LCI和Co-IP实验均证实了MsDUF3700与MsSLY1在细胞核内存在直接的物理互作。

3.3. Ectopic expression of MsSLY1promotes growth in Arabidopsis

为了验证MsSLY1的功能，研究团队在拟南芥sly1突变体中异位表达了MsSLY1。转基因株系部分恢复了sly1突变体的生长缺陷，包括根系伸长恢复、种子萌发率提高、子叶面积增大、株高和地上部生物量增加。这表明MsSLY1在功能上是保守的。此外，在野生型拟南芥中过表达MsSLY1也能促进生长，进一步证实了其作为植物生长正调控因子的作用。

3.4. MsSLY1 interacts with MsDELLA and facilitates its degradation

已知SLY1通过靶向降解DELLA蛋白来传递GA信号。本研究通过Y2H、BiFC、LCI和Co-IP实验证实，MsSLY1同样与紫花苜蓿的DELLA蛋白（MsDELLA）发生互作。结构域分析显示，MsSLY1的C端区域对结合MsDELLA至关重要。无细胞降解实验表明，与野生型相比，从MsDUF3700OE紫花苜蓿植株中提取的蛋白能更快速地降解外源添加的GST-MsDELLA蛋白，而蛋白酶体抑制剂MG132能阻断此过程。在拟南芥中，MsSLY1过表达株系的蛋白提取物也能加速DELLA降解，而sly1突变体的提取物则使其更稳定。这些结果证明MsSLY1能促进DELLA通过泛素-蛋白酶体途径降解，而MsDUF3700增强了这一过程。

3.5. MsDUF3700 modulates gibberellin biosynthesis and signaling

研究人员测定了MsDUF3700OE植株内源赤霉素含量，发现多个GA生物合成前体（如GA₅₃, GA₄₄, GA₁₉）显著积累，而具有生物活性的GA₁和GA₄仅发生适度变化。同时，RT-qPCR分析显示，多个GA生物合成基因（MsKAO1/2, MsGA20ox4/5, MsGA3ox1）表达上调，GA失活基因MsGA2ox8表达下调。此外，GA受体基因MsGID1B和MsSLY1表达上调，而负调节因子MsDELLA表达下调。这些结果表明，MsDUF3700通过协调调控GA的生物合成和信号传导，来促进植物生长。

3.6. Genetic relationship between MsDUF3700and MsSLY1

为了探究MsDUF3700和MsSLY1之间的遗传关系，研究人员在拟南芥sly1突变体背景下过表达了MsDUF3700。与sly1单突变体相比，sly1:MsDUF3700-OE植株的部分生长缺陷（如矮化、GA不敏感）得到了缓解，表现为根长增加、种子萌发率提高、子叶面积增大、株高和生物量部分恢复。然而，这种挽救并不完全，说明MsDUF3700无法完全替代SLY1的功能，而是与其协同作用，共同调控DELLA的周转和GA信号输出。

研究结论与意义

本研究系统阐明了紫花苜蓿未知功能域蛋白MsDUF3700在调控植物生长中的作用机制。主要结论如下：

1. 1.
   MsDUF3700是紫花苜蓿生长的正调控因子，其过表达能通过促进细胞伸长和组织扩张，显著提高植株的株高、茎粗和生物量。
2. 2.
   MsDUF3700在细胞核内与赤霉素信号通路的关键F-box蛋白MsSLY1发生直接的物理互作。
3. 3.
   MsSLY1功能保守，能够识别并结合DELLA蛋白，并促进其通过泛素-蛋白酶体途径降解。
4. 4.
   MsDUF3700通过增强MsSLY1介导的DELLA蛋白降解，并协调上调GA生物合成与信号传导相关基因的表达，从而精细调控GA通路，促进茎秆伸长。
5. 5.
   遗传学证据表明，MsDUF3700的功能依赖于MsSLY1，两者共同构成一个调控植物生长的功能模块。

这项研究的重要意义在于：

首先，它首次揭示了一个由DUF3700结构域蛋白参与调控赤霉素信号通路的具体分子机制，将一大类功能未知的蛋白质与经典的激素信号通路联系起来，拓展了人们对DUF蛋白生物学功能的认识。

其次，研究明确了MsDUF3700-MsSLY1-DELLA这一调控轴在紫花苜蓿茎秆发育中的核心作用，为理解豆科植物，特别是重要饲草作物株型建成的遗传基础提供了新的理论依据。

最后，从应用角度出发，MsDUF3700作为一个能显著改良株高和生物量性状的候选基因，为通过分子育种手段培育高产、优质的紫花苜蓿新品种提供了极具潜力的遗传改良靶点，对于保障畜牧业饲料供应和促进农业可持续发展具有潜在价值。