《Protein Science》：Structural and morphological dynamics of “on-path” and “off-path” oligomers of human islet amyloid polypeptide
编辑推荐：
本综述聚焦2型糖尿病(T2D)的关键病理特征——人胰岛淀粉样多肽(IAPP)的毒性聚集。研究结合动力学、原子力显微镜-红外光谱(AFM-IR)及细胞实验，首次系统揭示了IAPP在聚集早期会同步形成结构迥异、命运不同的两类寡聚体：以平行β-折叠为主、最终转化为淀粉样纤维的“通路内”环状寡聚体(DO)，以及以无序结构为主、持久存在但不转化为纤维的“通路外”球形寡聚体(RO)。研究进一步证明，这两类寡聚体与IAPP淀粉样蛋白随时间的结构演化共同导致了胰岛β细胞的高细胞毒性，为深入理解IAPP聚集的复杂机制及T2D的干预策略提供了重要见解。
引言
2型糖尿病(T2D)是一种影响全球数亿人的严重疾病，其病理特征之一是胰岛淀粉样多肽(IAPP)在胰腺胰岛中形成有毒的寡聚体和淀粉样纤维沉积，导致β细胞死亡、胰岛素分泌不足和慢性高血糖。尽管IAPP聚集与T2D的关联已被确认，但其聚集物种（特别是寡聚体）的结构演化动态和细胞毒性机制仍不清楚。本研究综合运用动力学分析、原子力显微镜(AFM)、原子力显微镜红外光谱(AFM-IR)以及细胞毒性实验，旨在解析IAPP聚集过程中的形态与结构动力学，并阐明不同聚集物种的致病性。
结果
2.1 IAPP聚集动力学揭示了一个以次级成核为主导的快速过程
通过硫黄素T(ThT)荧光动力学实验发现，在生理条件下，IAPP聚集有一个短暂的滞后时间(tlag≈ 3.11小时)，随后荧光强度迅速上升，表明纤维快速形成。计算得出的半时间(thalf≈ 3.94小时)与滞后时间非常接近，暗示寡聚体形成速率远慢于次级成核（即单体在已形成纤维表面发生聚集）的速率。利用AmyloFit软件对动力学数据进行拟合，结果显示IAPP聚集最符合次级成核主导模型，其平均残差(MRE)最低。这一模型表明，纤维可以作为“晶种”催化更多单体的聚集，导致寡聚体和纤维在同一群体中共存。A11抗体斑点印迹实验进一步证实，在聚集过程的1、4、8、24和48小时等多个时间点，均存在持续性的寡聚体种群，支持了存在不参与纤维形成的、稳定的“通路外”寡聚体。
2.2 IAPP聚集形成两种结构迥异的寡聚体，其中“通路内”的环状寡聚体(DO)可转化为纤维
通过AFM对聚集不同时间点的样品进行形貌分析，在早期阶段（1小时和4小时）观察到了两种形态各异的寡聚体：环状寡聚体(DO)和球形寡聚体(RO)。DO的平均高度约为17.48纳米，中间有凹陷；RO则为均匀的球形，平均高度约为14.26纳米。有趣的是，在8、24和48小时的样品中，DO不再被观察到，而RO则与大量纤维共存。这表明DO可能是“通路内”的中间体，最终转化为纤维；而RO是“通路外”的，在整个聚集过程中持续存在。
为深入解析结构，研究采用AFM-IR对单个聚集物的二级结构进行分析。结果表明，1小时形成的DO含有约40%的平行β-折叠和约20%的无序结构，而RO则主要由无序结构（约75%）和少量反平行β-折叠（约20%）构成。到了4小时，DO中的平行β-折叠含量显著增加至约60%，无序结构减少。而IAPP纤维的二级结构同样以平行β-折叠为主（60-80%），与DO高度相似。相反，在4小时和24小时观察到的RO，其结构仍然以无序结构为主（约70%）。综合形貌与结构数据，该研究得出结论：DO是富含平行β-折叠的“通路内”寡聚体，是纤维形成的前体；而RO是主要含无序结构的、持久存在的“通路外”寡聚体。
2.3 IAPP聚集体的结构演化与细胞毒性密切相关
为了评估不同阶段IAPP聚集物的细胞毒性，研究使用BRIN-BD11大鼠胰腺β细胞系，通过CellROX Deep Red流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平。结果显示，与阴性对照（7.27% ± 0.93%）相比，仅聚集1小时的IAPP样品就能显著诱导ROS升高（13.77% ± 1.82%），表明早期形成的聚集物就具有细胞毒性。聚集4小时（11.63% ± 0.76%）和8小时（11.37% ± 0.38%）的样品显示出与1小时样品相似的毒性水平。然而，聚集24小时和48小时的样品诱导的ROS水平显著更高，分别达到20.47% ± 2.11%和17.9% ± 0.66%。这表明，IAPP聚集体的毒性并非固定不变，而是随着聚集时间的延长和聚集物结构的演化而加剧。早期形成的持续性“通路外”寡聚体(RO)和后期富含β-折叠的成熟纤维共同导致了更高的细胞毒性。
讨论与结论
本研究通过多技术联用，清晰地描绘了IAPP聚集的动态图谱。IAPP聚集遵循次级成核主导的机制，导致“通路内”和“通路外”寡聚体与纤维长期共存。其中，富含平行β-折叠的DO是纤维形成的关键中间体，而富含无序结构的RO则是稳定、持久但“走错路”的聚集物种。细胞毒性实验证实，IAPP的致病性具有时间依赖性，既源于早期形成的持续性毒性寡聚体，也源于聚集物在结构演化过程中（特别是成熟纤维形成后）产生的协同毒性增强效应。这一发现挑战了早期认为只有低分子量寡聚体最具毒性的观点，强调了淀粉样蛋白毒性是其结构动态演化的结果。
研究的局限性与未来方向
本研究存在一定局限性，例如AFM和AFM-IR分析基于干燥的基底吸附样品，可能与生理溶液中的行为存在差异。细胞毒性实验仅使用了一种细胞系和一个毒性指标（ROS）。未来研究需要在原代细胞和模式生物中验证这些发现，并深入探究IAPP不同聚集物种诱导细胞毒性的具体分子机制，以更完整地揭示淀粉样蛋白结构演化与细胞功能障碍之间的联系。
实验方法概要
研究使用合成的人IAPP(1-37)多肽，在无搅动的37°C条件下进行聚集。通过ThT荧光监测聚集动力学，并使用AmyloFit软件进行模型拟合。通过AFM和AFM-IR对沉积在镀金硅基底上的样品进行形貌和纳米尺度二级结构分析。使用A11抗体（特异性识别寡聚体构象）进行斑点印迹，半定量不同时间点的寡聚体水平。细胞毒性实验则通过检测胰腺β细胞在接触不同阶段IAPP聚集物后产生的ROS水平来评估。
