SRC–EPHA2–PI3Kβ三元复合物驱动PTEN缺失肿瘤的致癌信号：一种超越传统PI3K激酶抑制的靶向治疗新策略

《Cancer Discovery》：A SRC–EPHA2–PI3Kβ tripartite complex drives oncogenic signaling in PTEN-nul... Open Access

本刊重磅推荐：针对PTEN（磷酸酶和张力蛋白同源物）缺失的癌症，目前仍缺乏有效靶向疗法。本研究揭示了一种全新的关键机制：PTEN缺失会诱导PI3Kβ（磷脂酰肌醇3-激酶β亚基）在Y962位点的磷酸化，并与EPHA2（促红细胞生成素产生性肝细胞癌A2型受体）、SRC（肉瘤病毒基因同源物）形成三元复合物，激活致癌性的pERK（磷酸化细胞外信号调节激酶）/c-MYC（细胞骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物）和pAKT（磷酸化蛋白激酶B）通路，驱动肿瘤发生。这项开创性工作确立了p-PI3KβY962（磷酸化PI3KβY962）作为可成药靶点和生物标志物，并为重新利用已获批药物达沙替尼（dasatinib）治疗PTEN缺失实体瘤的临床试验指明了方向，具有改变广大患者治疗前景的巨大潜力。

　　

在癌症研究中，肿瘤抑制基因PTEN（磷酸酶和张力蛋白同源物）的缺失是驱动肿瘤进展和治疗耐药的关键因素，然而针对PTEN缺失肿瘤的靶向疗法至今仍是空白。PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）通路是PTEN缺失导致的最常被激活的致癌通路之一。值得注意的是，在PTEN缺失的背景下，癌细胞会表现出对PI3Kβ亚型（由PIK3CB基因编码）的特异性依赖，而对常用的PI3Kα抑制剂产生耐药。尽管遗传学研究表明敲除PI3Kβ可抑制PTEN缺失肿瘤的生长，但靶向其激酶活性的药物在临床前模型和患者中的疗效却不尽相同。这提示，在PI3Kβ的经典激酶功能之外，可能还存在一种在PTEN缺失肿瘤中起关键作用的替代机制。

为了探索这种可能性，研究人员利用邻近标记技术BioID（生物素鉴定），在PTEN缺失的乳腺癌细胞中绘制了PI3Kα和PI3Kβ的相互作用蛋白组。结果发现，在两种不同的PTEN缺失三阴性乳腺癌细胞系中，PI3Kα和PI3Kβ的相互作用组存在显著差异，重叠度仅约30%。通过质谱分析，EPHA2（促红细胞生成素产生性肝细胞癌A2型受体）被鉴定为与PI3Kβ特异性结合且丰度最高的相互作用蛋白，而PI3Kα并未显示此相互作用。随后的免疫共沉淀和免疫荧光实验证实，内源性EPHA2在PTEN缺失细胞中与PI3Kβ（而非PI3Kα）相互作用，并在细胞膜上共定位。进一步研究发现，在PTEN野生型细胞中，EPHA2与PI3Kα和PI3Kβ的相互作用水平相当；但在PTEN敲除的细胞中，EPHA2与PI3Kβ的结合显著增强，而与PI3Kα的结合则减弱。反之，在PTEN缺失细胞中重新表达PTEN，则会显著削弱EPHA2与PI3Kβ的相互作用。这些结果表明，PTEN的缺失特异性促进了EPHA2与PI3Kβ之间的强相互作用。

为了阐明其背后的分子机制，研究人员对PTEN的蛋白质酪氨酸磷酸酶活性进行了探究。他们发现，在PTEN敲除的细胞中，免疫沉淀得到的PI3Kβ（而非PI3Kα）的酪氨酸磷酸化水平显著升高。通过在PTEN缺失的癌细胞中重新表达野生型PTEN或不同磷酸酶活性缺陷的突变体（如脂质磷酸酶缺陷的G129E、蛋白质磷酸酶缺陷的Y138L、双磷酸酶缺陷的C124S），证明了PTEN的蛋白质磷酸酶活性（而非其脂质磷酸酶活性）是下调PI3Kβ酪氨酸磷酸化的关键。此外，蛋白质磷酸酶活性完整的PTEN-WT和PTEN-G129E突变体能显著削弱PI3Kβ与EPHA2的相互作用，而蛋白质磷酸酶缺陷的Y138L和C124S突变体则无此能力。这表明PTEN作为蛋白质酪氨酸磷酸酶，通过去磷酸化作用调控PI3Kβ的磷酸化状态及其与EPHA2的相互作用。

接下来，研究人员通过质谱分析鉴定了在PTEN缺失背景下PI3Kβ上被特异性磷酸化的位点：酪氨酸962位点（Y962）和苏氨酸930位点（T930）。其中，Y962在多个物种中高度保守。体外去磷酸化实验显示，具有蛋白质磷酸酶活性的PTEN-WT和PTEN-G129E能够有效去除合成PI3Kβ肽段上Y962的磷酸基团，而PTEN-Y138L和C124S则不能。但所有PTEN变体均不能去除T930的磷酸基团，这确认了PTEN是直接靶向PI3Kβ Y962位点的酪氨酸磷酸酶。

为了验证Y962磷酸化在PI3Kβ-EPHA2相互作用中的功能，研究团队构建了模拟非磷酸化状态（Y962F）和模拟磷酸化状态（Y962E）的PI3Kβ突变体。在PTEN缺失的细胞中，表达非磷酸化突变体PI3Kβ-Y962F会显著削弱其与EPHA2的结合，而模拟磷酸化的Y962E突变体在PTEN野生型细胞中则能增强这种结合。免疫荧光结果进一步支持了这一结论：PI3Kβ-Y962E主要定位于细胞膜并与EPHA2共定位，而PI3Kβ-Y962F则主要位于细胞质。这些结果表明，PI3Kβ在Y962位点的磷酸化增强了其与EPHA2的相互作用，并促进PI3Kβ向细胞膜定位。

为了评估PI3Kβ酪氨酸磷酸化在肿瘤发生中的功能重要性，研究人员在体内模型中进行了验证。在源自Pten/Trp53双敲除小鼠的原发性乳腺癌细胞中，重新表达野生型小鼠PI3Kβ可恢复其致瘤性，而表达模拟去磷酸化的Y956F（对应人源Y962）突变体则显著削弱了肿瘤生长和细胞增殖标志物Ki67的表达。在PTEN缺失的人前列腺癌PC3细胞模型中也观察到了类似的结果：PI3Kβ-Y962F突变体失去了促进肿瘤生长的能力。这些数据表明，PI3Kβ的酪氨酸磷酸化对于多种PTEN缺失癌症模型的体内肿瘤发生至关重要。

为了将这一发现推向临床转化，研究团队开发了一种能够特异性识别人源p-PI3Kβ^Y962（磷酸化PI3Kβ^Y962）的多克隆抗体。该抗体在多种细胞系中得到验证。使用此抗体对临床样本进行分析发现，在三阴性乳腺癌和前列腺癌患者中，p-PI3Kβ^Y962的水平与PTEN的表达呈强烈的负相关。在PTEN突变的肿瘤中，p-PI3Kβ^Y962信号显著高于PTEN野生型肿瘤。更有意义的是，在前列腺癌中，更高的p-PI3Kβ^Y962水平与更高的格里森（Gleason）评分（提示更差的预后）显著相关。这些结果确立了p-PI3Kβ^Y962作为PTEN缺失的潜在预后生物标志物。

在机制层面，研究深入探索了p-PI3Kβ^Y962如何通过EPHA2激活下游致癌信号。在PTEN缺失的癌细胞中，敲低PI3Kβ会选择性降低磷酸化ERK（pERK）及其下游靶点c-MYC（细胞骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物）的水平。重新引入具有蛋白质磷酸酶活性的PTEN（WT或G129E）可下调pERK和c-MYC，而蛋白质磷酸酶缺陷的突变体（Y138L, C124S）则不能，表明PTEN的蛋白质磷酸酶功能是抑制ERK/c-MYC通路的关键。在PI3Kβ敲低的细胞中，只有重新表达野生型PI3Kβ或其激酶失活突变体K805R能恢复pERK和c-MYC，而Y962F突变体则不能，这说明PI3Kβ-Y962的磷酸化（而非其激酶活性）对于激活这条通路至关重要。同样，敲低或抑制EPHA2也能降低pERK和c-MYC。功能实验进一步表明，PI3Kβ-WT能增强EPHA2的激酶活性，而PI3Kβ-Y962F则丧失了此能力。通过敲低ERK或用ERK抑制剂处理，可以阻断由重新表达PI3Kβ引起的c-MYC蛋白水平升高（通过稳定c-MYC而非增加其转录），并抑制细胞增殖。有趣的是，尽管PI3Kβ-Y962F和激酶失活突变体K805R都能降低pAKT水平，但体外脂质激酶活性检测显示，Y962F突变体保留了完整的激酶活性，而K805R则完全丧失。同时，K805R突变体仍能与EPHA2结合并激活ERK/c-MYC通路。这些发现提示，PI3Kβ的Y962磷酸化对于其结合并激活EPHA2、进而驱动ERK/c-MYC信号是必需的。而p-AKT的降低可能是由于EPHA2与磷酸化PI3Kβ的相互作用，将PI3Kβ募集到细胞膜，增加了其接触底物PIP2（磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸）的机会，从而间接影响了经典的PI3K-AKT通路。

最后，研究致力于寻找负责磷酸化PI3Kβ Y962的酪氨酸激酶。通过生物信息学预测和针对60种酪氨酸激酶抑制剂的靶向化合物筛选，发现SRC家族抑制剂达沙替尼（dasatinib）和KX2-391能有效抑制表达野生型PI3Kβ的PTEN缺失癌细胞生长，但对表达PI3Kβ-Y962F突变体的细胞效果显著减弱。这两种抑制剂都能降低p-PI3Kβ^Y962以及pERK/c-MYC的水平。机制上，敲低SRC或EPHA2都会降低p-PI3Kβ^Y962和c-MYC。体外激酶实验证实，SRC和EPHA2都能直接磷酸化PI3Kβ的Y962肽段，其中SRC的磷酸化能力更强。进一步的救援实验表明，在SRC敲低的细胞中，外源表达EPHA2能部分恢复pERK/c-MYC信号；但在EPHA2敲低的细胞中，外源表达SRC则无法恢复该信号。这提示SRC和EPHA2在磷酸化PI3Kβ上存在协作，且EPHA2可能位于SRC的下游或是一个必需的平台。

综上所述，本研究揭示了一个全新的致癌机制模型：在PTEN缺失的背景下，PI3Kβ在Y962位点的磷酸化水平因失去PTEN的去磷酸化作用而升高。磷酸化的p-PI3Kβ^Y962与EPHA2和SRC形成稳定的三元复合物。在此复合物中，SRC与EPHA2协同作用，进一步磷酸化并激活PI3Kβ，形成一个正反馈环路。该复合物触发EPHA2的激活，进而驱动pERK/c-MYC致癌信号通路，同时通过将PI3Kβ募集至膜，也增强了经典的PI3K-AKT通路，最终驱动PTEN缺失肿瘤的进展。重要的是，FDA已批准的SRC/EPHA2抑制剂达沙替尼，能有效抑制p-PI3Kβ^Y962，并在PTEN缺失（而非PTEN野生型）的临床前肿瘤模型中表现出强大的抗肿瘤活性。因此，p-PI3Kβ^Y962不仅是一个有前景的治疗靶点，也是一个可用于患者分层的预测性生物标志物。这项工作为开发针对p-PI3Kβ^Y962的特异性抑制剂，以及基于生物标志物指导、重新利用达沙替尼治疗PTEN缺失实体瘤的临床试验奠定了坚实基础，有望解决这一领域长期未满足的临床需求。