《Molecular Cancer Therapeutics》：Shaping Tumor Microenvironment by Amplifying the Complement Cascade for Improved Immune Response in Pancreatic Cancer Model
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本研究在胰腺癌模型中，探索了通过膜锚定型Properdin（mFP）增强αGal（半乳糖-α-1,3-半乳糖）抗体介导的补体级联反应，以改善免疫应答的治疗新策略。研究证明，mFP可显著增强补体依赖的细胞毒作用（CDC）和肿瘤微环境（TME）的免疫重塑，为αGal疗法提供了有力的增强工具。文章还介绍了经蛋白工程改造的新型寡聚化mFP功能单元，其在人全血模型中展现出更强的靶细胞杀伤和吞噬作用，为抗体免疫治疗提供了新的增效思路。
摘要
癌症免疫疗法旨在利用人体自身的免疫系统来识别、攻击和根除癌细胞。其中，利用针对半乳糖-α-1,3-半乳糖（αGal）的天然抗体进行异种排斥的策略已被用于癌症治疗，其疗效部分归因于补体系统的激活。本研究旨在通过运用备解素[又称Factor P（FP）]，即目前已知的唯一阳性补体调节因子，来增强这一反应。研究者在鼠源和人源胰腺癌细胞上表达了膜锚定型备解素（mFP），并评估了其增强αGal介导补体激活的能力。结果显示，在Panc02细胞上异位表达小鼠mFP（muP）能在体外提高C3沉积水平，并在人补体存在时诱导更强的补体依赖性细胞毒性（CDC）。在模拟人体系统的、具有循环抗αGal抗体的免疫化Ggta1敲除小鼠模型中，mFP表达显著延迟了肿瘤生长，并与肿瘤微环境（TME）免疫景观的显著重塑相关。具体而言，研究者观察到常规1型树突状细胞（cDC1）明显增加，肿瘤相关单核细胞/巨噬细胞（TAM）减少并转向促炎表型，CD8+T细胞向祖细胞衰竭状态转变。通过重构mFP结构以创建人工C3转化酶结合位点，并引入胞内寡聚化结构域，进一步改善了在人全血环模型中靶细胞的杀伤和单核细胞介导的吞噬作用。这些发现表明，在鼠源胰腺癌模型背景下，放大补体激活可以延迟肿瘤生长并改变TME。此外，研究还开发出一种新型膜结合的寡聚化FP功能单元，可有效引发强大的补体激活。
引言
癌症免疫疗法是一个快速发展的领域。αGal是一种糖基修饰，由糖蛋白α-1,3-半乳糖基转移酶（GGTA1）催化生成，除人类、猿类和旧大陆猴外，普遍存在于哺乳动物细胞。在进化过程中，人类丢失了GGTA1基因，反而产生了高滴度的抗αGal抗体，约占免疫球蛋白总量的1%，以IgG、IgM和IgA同种型存在。抗αGal抗体对肿瘤细胞的调理作用已被证明可启动补体激活，并导致肿瘤细胞的补体依赖性细胞毒性（CDC）。
考虑到CDC在单克隆抗体介导的靶向清除肿瘤细胞中的关键作用，研究者假设使用备解素增强补体激活可以提高αGal疗法的疗效。备解素（FP）是唯一被确定的补体阳性调节因子，其功能是稳定参与替代途径（AP）的转化酶，从而延长AP C3转化酶C3bBb的半衰期，并阻止因子I在因子H介导下对C3b的裂解。在生理条件下，FP主要以二聚体、三聚体和四聚体的形式循环，形成头尾相连的环形结构。FP的C3b结合位点位于环形寡聚体的连接顶点。
本研究旨在利用膜锚定型FP（mFP）来放大由αGal癌症免疫疗法引发的补体激活。研究选择胰腺导管腺癌作为具有挑战性的实体瘤代表模型，因其进展迅速、肿瘤微环境（TME）具有免疫抑制性且对现有免疫疗法反应有限。研究结果表明，mFP增强了抗αGal依赖的补体激活，在测试的鼠模型中导致肿瘤生长延迟和TME重塑。通过蛋白质工程，特别是重排TSR结构域和引入胞内寡聚化结构域，研究者观察到了在人全血模型中补体激活、吞噬作用和癌细胞细胞毒性的改善。
材料与方法
本研究使用了鼠胰腺癌细胞系Panc02以及人胰腺癌细胞系Panc-1和MiaPaca-2。所有细胞均在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。动物研究遵循3R原则，使用Ggta1敲除小鼠进行。为产生抗αGal小鼠，用粘蛋白和poly I:C免疫Ggta1-KO小鼠。通过基因工程构建了小鼠膜锚定型FP（muP）和人膜锚定型FP（huP）及其多种改造版本（huP-1至huP-6）的载体，并利用慢病毒转导技术将其表达在目标细胞上。细胞表面αGal和mFP的表达通过流式细胞术检测。
体外细胞生长通过细胞计数进行量化。抗体和C3沉积实验通过将细胞与正常人血清（NHS）或抗αGal小鼠血清（AMS）共孵育后进行流式检测。CDC实验通过测量细胞膜损伤后染料荧光来量化死细胞百分比。通过siRNA敲低膜补体调节蛋白（CD46、CD55、CD59）的表达，并评估对CDC的影响。通过Western blotting检测蛋白表达。人全血环实验中，将荧光标记的癌细胞与新鲜全血共孵育，通过流式分析癌细胞死亡和吞噬情况。
动物实验中，将Panc02野生型（WT）或表达muP的细胞皮下接种到免疫化或未免疫化的Ggta1-KO小鼠体内，监测肿瘤生长。在肿瘤植入后第18天收集肿瘤，通过酶消化和流式细胞术分析肿瘤浸润白细胞（TIL）的组成和表型。数据分析使用FlowJo和GraphPad Prism软件，采用t检验、ANOVA等方法进行统计学分析。
结果
鼠源重组mFP增强了癌细胞上αGal表位诱导的补体激活
研究者证实鼠胰腺癌细胞系Panc02上存在αGal表位，并会引发IgG调理作用和细胞表面的补体激活，表现为C3沉积。为在癌细胞表面富集FP，研究者构建了将鼠FP与鼠CD80跨膜结构域和截短的胞质尾融合的muP。在Panc02细胞上表达muP后，证实了其表面表达。实验发现，表达muP显著增强了AMS诱导的C3沉积。然而，与AMS共孵育时，这种C3积累不足以诱导CDC。相比之下，与NHS共孵育时可检测到显著的CDC，并且muP充分放大了αGal诱导的CDC。这些发现表明，在鼠癌细胞上异位表达muP可以增强抗体调理作用引发的补体激活，但CDC并未完全执行。
muP延迟肿瘤生长并改变了TME的免疫组成
鉴于mFP在体外显著增强了补体激活，研究者在其同源鼠模型中探索了其治疗潜力。首先免疫具有免疫能力的Ggta1-KO C57BL/6小鼠以产生抗αGal抗体来模拟人体情况。随后皮下植入Panc02 WT和表达muP的细胞，并监测肿瘤生长。尽管表达muP的Panc02在体外和未接种疫苗的小鼠体内与WT生长速度相似，但在接种疫苗的Ggta1-KO小鼠中显示出更慢的生长速度，显著改善了生存率。这些数据表明，muP增强的补体激活以抗αGal依赖的方式有助于延迟肿瘤生长。
为了更深入了解muP的治疗机制，在植入后第18天收集肿瘤浸润CD45+细胞，通过流式分析TME。在总肿瘤浸润白细胞中，未观察到髓系细胞和T细胞百分比在表达与不表达muP的肿瘤间有显著差异。然而，注意到髓系细胞组成发生了显著变化。在表达muP的肿瘤中，常规1型树突状细胞（cDC1s）显著增加，同时肿瘤相关单核细胞/巨噬细胞（TAMs）减少，中性粒细胞浸润有升高趋势。在这些肿瘤的TAMs中，PD-L1表达降低，并且iNOS+Arginase-1?TAMs的比例高于对照肿瘤，这表明其具有更强的促炎表型。
除了髓系细胞的促炎重编程外，表达muP肿瘤中的T细胞在耗竭状态上发生了转变，更倾向于增殖性的祖细胞耗竭表型（TCF1+TIM-3?），而非终末耗竭表型（TCF1+TIM-3+）。同时，CD8+与CD4+T细胞的比例、CD8+组织驻留记忆细胞（CD103+）百分比或调节性T细胞（Foxp3+CD25+）百分比未观察到变化。这些发现表明，异位表达muP可以通过改变鼠胰腺癌模型中的免疫抑制性TME来抑制肿瘤生长。
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huP不足以克服补体负调节因子的调控
为了在人体系统中验证这一概念，研究者对两种人胰腺癌细胞系Panc-1和MiaPaca-2进行了基因改造，使其表达GGTA1和人源重组mFP。与muP类似，huP是通过将FP与人CD8a跨膜结构域和人TCR-β胞质尾融合构建的。表面huP表达得到确认，并评估了其增强αGal诱导补体激活的能力。与在鼠细胞上观察到的C3沉积增强相反，引入huP未能增强人胰腺癌细胞系上αGal诱导的C3沉积，这可能是由于αGal抗体沉积已经引发了较高的C3沉积。此外，与人血清孵育时，在工程化的Panc-1或MiaPaca-2细胞中均未观察到CDC。研究者随后探究了huP在人胰腺癌背景下激活作用受限是否归因于负性补体调节因子的存在。由于膜补体调节蛋白（mCRPs）CD46、CD55和CD59是保护细胞免受补体攻击的关键调节因子，研究者在成功敲低CD46、CD55和/或CD59后进行了CDC实验。敲低CD46或CD59并未使细胞对CDC敏感。然而，敲低CD59显著促进了表达αGal表位的细胞的裂解，并且huP的存在显著增强了细胞裂解。总之，这些结果表明CD59是阻断αGal和huP诱导补体激活的主要抑制剂。在人胰腺癌背景下，huP不足以在体外推动补体级联反应对抗负调节因子。
重组huP在全血环系统中增加了细胞毒性
前述结果促使研究者通过新的构象设计来改进huP的功能。FP天然以二聚体、三聚体或四聚体形式存在。FP的转化酶结合位点通常由一个单体的N端和另一个相邻单体的C端形成。四聚体FP在不同寡聚状态中显示出最高的活性。然而，huP在细胞表面展示的寡聚状态和立体构象仍不确定，因为huP构建体是通过直接将一个FP单体连接到跨膜结构域上创建的。因此，研究者交换了FP的N端和C端，以人工组装在FP寡聚体中发现的转化酶结合顶点。此外，还引入了胞内寡聚化结构域以促进huP在细胞表面的多聚化。总共产生了六个具有不同连接子长度和胞内结构域的构建体，命名为huP-1至huP-6。huP-1、-3和-5有较短的柔性连接子，而huP-2、-4和-6有较长的柔性连接子。huP-1和-2像原始huP一样只有跨膜结构域和短胞质尾。huP-3和-4在跨膜螺旋后有一个广泛使用的三聚体接头GCN4pII，而huP-5和-6则有GCN4pIL，它是GCN4pII的突变体，倾向于形成四聚体。
Panc-1被改造以表达这六种新的huP构建体，并通过流式检测了新huP的表达。构建体huP-3、-4、-5和-6显示出比huP-1和-2更高的表达。通过Western blotting从Panc-1 huP-3、-4、-5和-6的细胞裂解物中检测到了寡聚化的huP。随后在表达新huP的Panc-1细胞上进行了C3沉积实验以筛选最佳构建体。huP-3、-4、-5和-6显著引起细胞表面C3沉积升高，而huP-1和-2的活性则低得多。由于huP-3、-4、-5和-6之间没有观察到明显差异，研究者选择了huP-3，即具有更广泛使用的寡聚化结构域pII的最短变体，用于进一步研究。随后，改造Panc-1 GGTA1细胞以表达huP-3，并评估了huP-3增强αGal触发补体激活的能力。令人鼓舞的是，与原始构建体相比，引入重新设计的huP后，细胞表面C3沉积显著增加。
考虑到在鼠模型中评估人补体激活和CDC的挑战，研究者采用了全血环实验来评估新设计的huP是否能改善靶癌细胞杀伤和吞噬作用，其中癌细胞与具有完整补体系统的新鲜全血共孵育。在孵育15分钟后收集样本进行流式分析。值得注意的是，尽管存在显著的供体间差异，但huP-3诱导的癌细胞杀伤和单核细胞介导的吞噬作用显著强于huP。然而，中性粒细胞介导的吞噬作用的改善较小。这些数据表明，重新设计的huP进一步改善了αGal引发的补体激活，从而改善了靶细胞杀伤和单核细胞介导的吞噬作用
