《Nature Aging》：Multi-tissue transcriptomic aging atlas reveals predictive aging biomarkers in the killifish
编辑推荐：
本研究通过对短寿命脊椎动物模型——非洲青鳉进行大规模、多时间点的多组织转录组测序，构建了首个性别平衡的衰老图谱。该工作系统揭示了不同组织衰老的转录组动态、性别差异及进化保守性，发现了与髓系偏移相关的性别特异性变化，并构建了高精度的组织特异性“转录组时钟”，为理解脊椎动物衰老的分子机制及评估抗衰老干预措施提供了宝贵资源。
一个大规模衰老图谱涵盖多样组织、多个年龄和平衡的性别代表性
为了理解青鳉不同组织如何衰老，研究者构建了一个包含677个样本的多组织转录组衰老图谱，这些样本来自两个独立的青鳉衰老队列。他们对这些鱼进行了心脏灌注，以减少循环免疫细胞对组织转录组特征的影响，从而能够发现组织驻留细胞类型的年龄依赖性变化。他们分析了13种组织（骨、脑、视网膜/视网膜色素上皮、脂肪、肠道、卵巢/睾丸、心脏、头肾、肝脏、肌肉、皮肤、脊髓和脾脏）在六个年龄组中的表达，涵盖了从100%到约20%的群体存活率。雄性和雌性在大多数组织中都以相似的频率被取样。利用基于Smart-seq2的高灵敏度、高通量文库制备流程，他们生成了一个高质量数据集。主成分分析也显示了按组织类型的样本聚类。为了从全面的数据集中获得洞见，研究者遵循了系统性的方法。首先，他们量化了与年龄、性别和年龄-性别相互作用相关的全局方差。接着，他们识别了在组织间共享或具有性别特异性的年龄相关基因表达变化，并分析了这些基因在小鼠和人类中的进化保守性。然后，他们通过轨迹分析检查了基因表达动态。最后，他们基于图谱数据构建了性别特异性和性别组合的转录组时钟，并用它们来预测寿命干预措施的效果。
衰老对转录组的影响在不同组织间存在差异
为了表征每个组织中基因表达随年龄变化的趋势，研究者利用了他们数据集的时间序列特性，并使用斯皮尔曼等级相关性来描述基因表达随年龄变化的单调性。肌肉、皮肤和视网膜/视网膜色素上皮等组织具有与年龄关联最强的基因。接下来，他们将绝对斯皮尔曼等级相关大于0.5的基因定义为年龄相关基因。他们观察到，在所有组织中，肌肉的转录组中年龄相关基因的比例最高。其他组织（视网膜/视网膜色素上皮、皮肤、脊髓、脂肪、大脑和心脏）具有中等水平的年龄相关基因，约为6-13%。年龄相关基因比例较低（约2.5%）的组织包括脾脏、头肾、肝脏、肠道、性腺和骨骼。这些组织水平的差异也通过方差分割分析观察到，突显了衰老对不同组织转录组的影响程度各不相同。
年龄改变的通路在两性间大多共享，但也存在性别差异通路
组织特异性变化可能源于每种组织独特的生理和功能，指出了特定组织背景下独特的衰老机制，并揭示了针对每种组织衰老的潜在干预节点。组织背景可能取决于组织来源动物的生物学性别，因为不同组织转录组中雄性和雌性表达差异的基因比例各不相同。例如，性腺在所有年龄组中平均约有95%的基因存在性别差异表达，肝脏约有25%，皮肤约有15%，头肾约有14%，脂肪约有6%且在147-155天龄时达到峰值。一致地，方差分割分析显示，性别在性腺、皮肤、脂肪和头肾的转录方差中占了相当大的比例，而年龄-性别相互作用在肝脏的方差中占了很高的比例。在特定组织中，两性间组织转录组的显著性别效应也在小鼠和人类的类似组织中观察到。
为了并置比较每种组织中衰老转录组的雄性-雌性差异，研究者按组织和性别分离了他们的数据集，然后计算了每个基因的斯皮尔曼等级相关，接着进行基因集富集分析或超几何基因本体富集分析，以识别每种组织和每种性别中受年龄改变的通路。通常，在给定的组织类型中，他们发现显著富集的基因本体术语在年龄变化方向（上调或下调）上对两性是相同的，无论该组织转录组的性别二态性程度如何。驱动这些通路的基因在雄性和雌性之间大多相似，尽管存在差异，这表明衰老以类似的方式改变雄性和雌性组织的许多通路，尽管受年龄改变的确切基因可能不同。
有趣的是，也存在一些基因本体术语在两性中显示出相反的年龄上调或下调方向，而且通常年龄变化仅在一种性别中具有统计学显著性。通过基因集富集分析，根据组织类型，这些性别差异的基因本体术语在雄性或雌性中随年龄上调。这些基因本体术语涉及肠道中的蛋白质稳态、心脏和脾脏中的细胞间和细胞内运输、以及脊髓中的核糖体。自噬和髓系细胞调节这两个性别差异的基因本体术语存在于各种组织中，如脂肪、视网膜/视网膜色素上皮、性腺、头肾、脊髓和脾脏。这些结果表明，虽然衰老可以类似地改变雄性和雌性组织的通路，但这些变化的方向可能因性别而异，反映了雄性和雌性在转录组水平上衰老方式的差异。
一些年龄改变的通路是每个组织独有的
有几个通路仅在一种或少数几种组织中随年龄改变。例如，基因集富集分析显示，在肌肉中，一些随年龄下调的术语与血管生成和骨化有关。在肠道中，与代谢相关的通路随年龄改变，例如“糖异生调节”。尽管大多数基因本体术语在不同组织间随年龄上调或下调一致，但也有一些通路通过基因集富集分析显示出强烈的组织依赖性年龄变化。例如，对于两性，通过基因集富集分析，与核糖体相关的术语在皮肤和大脑中随年龄上调，但在脾脏、脂肪和视网膜/视网膜色素上皮中随年龄下调。在雌性中，与细胞外基质相关的术语在肝脏、脂肪、视网膜/视网膜色素上皮和卵巢中上调，但在皮肤、肌肉和骨骼中下调。与核糖体相关和细胞外基质相关的过程如何受衰老调节，可能是为了适应不同组织对核糖体活性和细胞外组织与功能的不同需求。
免疫和细胞外基质基因在多种组织中随年龄变化
哪些通路在多种组织中普遍受年龄改变？共享的变化可能指示调节衰老的系统性因素或衰老过程的共享跨组织后果。研究者识别了几个在至少六种组织中普遍受年龄改变的通路。对于两性，这些通路包括“免疫反应”的上调和细胞周期以及线粒体术语的下调。具体对于雄性，细胞外基质相关的术语在组织间共享。这些通路先前曾在青鳉组织的子集中被报道过，并让人联想到衰老的关键标志，包括“慢性炎症”的上调和“细胞衰老”以及“线粒体功能”和“细胞间通讯”的改变。
互补地，研究者一起分析了雄性和雌性样本，并识别了47个在至少六种组织中共享的年龄相关基因，包括22个随年龄上调的基因和25个随年龄下调的基因。在这47个基因中，有14个上调基因和25个下调基因具有人类直系同源物。一致地，为跨组织年龄相关基因富集的通路包括免疫反应（上调）和细胞外基质组织（下调）术语。
他们使用RNA原位杂交验证了肠道中两个顶级共享年龄相关基因的年龄改变表达，肠道是这些基因绝对斯皮尔曼等级相关最高的组织。他们发现青鳉基因LOC107373777的转录本主要定位于细胞核，其水平随年龄增加。这个基因在参考基因组中被注释为编码一个功能未知的长链非编码RNA。他们使用非编码RNA序列数据库RNAcentral来识别与ncRNA-3777相似的人类、小鼠和斑马鱼RNA序列。几乎所有这些序列都被预测为长链非编码RNA，并且大多数功能未知。其中一个有趣的序列是人类长链非编码RNA，它与青鳉ncRNA-3777具有最高的查询覆盖率和序列同一性。这个人类长链非编码RNA是PVT1非编码RNA基因座的一部分，已在多种肿瘤类型中被鉴定为候选癌基因，这可能表明ncRNA-3777在青鳉中具有生理作用。
相比之下，IGF2BP3基因的转录本是核质共定位的，其水平随年龄下降。IGF2BP3基因的人类直系同源物编码一种RNA结合蛋白，可促进胰岛素样生长因子2蛋白翻译。青鳉IGF2BP3蛋白的氨基酸序列与人类蛋白有75.91%的同一性。AlphaFold预测青鳉IGF2BP3蛋白具有六个蛋白结构域。因此，青鳉IGF2BP3基因编码一个在哺乳动物中高度保守的蛋白，其随年龄下调可能表明青鳉中IGF2依赖性信号随年龄减弱。
年龄相关基因通路的分析揭示了跨脊椎动物的保守性
为了评估基因和通路水平的保守性，研究者首先比较了青鳉组织中的年龄相关差异表达基因与小鼠和人类对应组织中的差异表达基因。骨骼肌、皮肤和脂肪组织在青鳉和两种哺乳动物之间显示出许多共享的上调和下调的衰老差异表达基因，并且大多数组织至少有几个统计学上显著的差异表达基因在青鳉与小鼠或人类之间具有相同的年龄变化方向。接下来，他们将青鳉大脑年龄差异表达基因与小鼠大脑“共同衰老评分”进行比较，该评分由82个定义小鼠大脑全脑衰老特征的基因组成。他们发现青鳉大脑差异表达了13个共同衰老评分基因，其中11个基因的变化方向与小鼠相同，包括与补体级联、小胶质细胞激活和溶酶体通路相关的基因。这些基因例证了脊椎动物衰老大脑的保守转录组特征。
最后，他们通过基因集富集分析评估了通路水平的保守性。他们发现心脏、内脏脂肪组织、大脑和免疫系统在青鳉和人类之间显示出最大的年龄改变通路重叠。相比之下，在青鳉和小鼠之间，脂肪组织、心脏和肝脏在通路水平上表现出最大的重叠。特定的年龄相关转录程序在三种脊椎动物物种之间广泛保守，包括免疫调节和代谢重塑。例如，免疫相关通路随年龄上调，而特定的代谢通路随年龄下调。这些衰老相关分子特征在鱼类、啮齿动物和人类之间的趋同性强调了脊椎动物衰老表现出的进化保守特征。
轨迹分析揭示不同类别的基因表达行为
虽然揭示随年龄的单调变化是有益的，但斯皮尔曼等级相关无法区分线性与非线性变化，也无法区分具有稳定年龄轨迹的基因与具有复杂动力学的基因。先前的研究表明，年龄相关的基因表达变化可以是非单调的。为了探索这些年龄相关的动态，研究者在每种组织中对基因表达轨迹进行了层次聚类，将基因分为十个簇，这是通过平衡簇稳健性与功能富集分析的基因集大小确定的最佳簇数。他们观察到表达轨迹簇具有独特的动态。例如，在大脑中，虽然簇1、2和3都随年龄下降，但它们的轨迹具有不同的形状。簇1显示出对数模式，在早期年龄下降，然后在剩余年龄中趋于平坦。这个簇主要富集于细胞周期和神经系统发育术语。簇2遵循线性模式，并富集于与神经系统发育相关的通路。最后，簇3显示出复杂的下降-平坦-再下降行为。这个簇富集于mRNA调控术语。这些通路的独特表达动态可能表明衰老过程中不同的调控网络或潜在原因。例如，大脑中簇1（细胞周期）的模式可能源于青鳉从青春期到成年期快速生长的停止。一致地，其他组织具有具有相似对数形状的簇，并富集于细胞周期通路。因此，通过研究基因动态，我们可以深入了解哪些生物过程在衰老过程中可能共同受调控。
青鳉肾髓中细胞类型组成随年龄变化
鉴于强烈的系统性免疫特征，研究者试图更好地了解青鳉的主要造血区室——头肾如何随年龄变化。与其他硬骨鱼一样，青鳉的肾脏由两部分组成。头肾是肾脏的前部，由包含造血组织的两个双侧叶组成，这是他们在图谱中取样的部分。躯干肾位于背侧体壁后部，主要包含外分泌组织。头肾转录组样本的主成分分析显示，沿主成分1的年龄和沿主成分2的性别有很强的分离。他们识别了头肾样本中516个绝对斯皮尔曼等级相关值大于0.5的基因。几个主要在T细胞、B细胞和淋巴祖细胞中表达的基因与年龄呈负相关，而主要在巨噬细胞、中性粒细胞和其他髓系细胞中表达的基因与年龄呈正相关。这些差异在雌性头肾中比在雄性头肾中更强，具有更高的绝对斯皮尔曼等级相关性和更大的统计学显著性。在通路水平上，“B细胞受体信号通路”和“DNA重组”术语随年龄下调。这些观察结果让人联想到小鼠和斑马鱼中的“髓系偏倚”现象，即造血谱系的细胞类型组成随年龄变化，老年时髓系谱系细胞与淋巴系细胞的比率增加。
细胞类型组成的变化是否促进了青鳉头肾中年龄相关的基因表达改变？他们首先使用已发表的头肾单细胞RNA-seq数据集对肾脏转录组进行单细胞反卷积。对于雌性，两个反卷积模型显示老年时髓系细胞的比例更高，主要是由于巨噬细胞或中性粒细胞的升高，但淋巴系细胞的比例没有随年龄显著变化。对于雄性，一个反卷积模型显示老年时淋巴系细胞的比例显著降低，特别是B细胞，而除中性粒细胞外的大多数髓系细胞没有随年龄显著变化。反卷积分析支持青鳉肾脏中细胞类型组成随年龄改变。
接下来，他们正交测量了不同的免疫细胞群体。他们优化了头肾解离方案，然后进行荧光激活细胞分选。他们验证了为斑马鱼开发的流式细胞术设门策略，发现雌性表现出年龄相关的细胞类型组成变化，而雄性则不太明显。与年轻雌性相比，老年雌性中推定的髓系细胞与推定的淋巴系细胞的比率显著增加，而相同年龄的雄性中这种增加较轻微且未达到统计学显著性。这种更明显的雌性细胞类型组成变化与在雌性基因表达中观察到的更强的年龄相关性一致。这种性别差异可能是由于他们的队列中雌性比雄性寿命更短，并且可能比雄性衰老得更快。
有趣的是，下调最强烈的基因中有两个是哺乳动物和斑马鱼中淋巴转录因子IRF4基因的直系同源物。这两个青鳉IRF4旁系同源物irf4a和irf4b具有不同的表达水平和模式，其中irf4a随年龄下调更强烈。他们通过RNA原位杂交验证了irf4a转录水平，表明irf4a mRNA可以在青鳉头肾造血组织富集的间质区域的细胞中与ptprc mRNA共表达，并随年龄下降。虽然他们目前无法验证Irf4a蛋白表达，但他们的结果提出了一个有趣的可能性，即irf4a随年龄下调可能减少淋巴系细胞分化，导致髓系细胞的相对丰度增加。
性别特异性转录组衰老时钟在特定情况下可以优于性别组合时钟
他们全面的转录组衰老图谱允许他们为每种组织开发年龄预测模型，即“衰老时钟”。使用大型数据集的分子特征，这些机器学习模型首先从已知实际年龄的样本中学习模式，然后将查询样本的分子模式与学习到的模式进行比较，以找到与查询最匹配的年龄，即“预测年龄”。这些时钟的发展加快了对遗传、药理学和生活方式衰老干预措施的评估。例如，基于实际年龄训练的表观遗传衰老时钟预测，当动物和人类接受有益的干预措施时，其“生物学年龄”更年轻。
为了构建组织特异性转录组衰老时钟，他们使用了三种机器学习建模策略，包括非线性贝叶斯流程BayesAge 2.0、弹性网络回归和基于主成分的回归。应用于他们的数据集时，这些模型具有不同的预测精度和残差行为，因此他们报告了所有三种方法的结果。
因为他们的数据集相对性别平衡，所以对于每种组织，他们比较了使用每种性别的转录组开发的衰老时钟与从性别组合转录组构建的衰老时钟的性能。他们观察到，一些性别特异性时钟的性能优于性别组合时钟，并且这一特征因组织类型和用于生成时钟的机器学习模型而异。例如，对于肠道，性别组合时钟在BayesAge 2.0和弹性网络模型中的性能优于性别特异性时钟，但在基于主成分的回归模型中，性别组合时钟与雄性特异性时钟的性能相似。对于心脏，雄性特异性时钟在所有三种机器学习模型中的性能都高于性别组合时钟，而对于大脑，雌性特异性时钟具有更高的性能。
三种机器学习模型在通过按性别拆分分析来提高时钟性能的普遍性方面存在差异。BayesAge 2.0在使[](@replace=1)用性别拆分数据集时受益最大：在测试的12种组织中，有11种组织的性别特异性时钟（一种或两种性别）的性能高于性别组合时钟。相比之下，对于弹性网络和基于主成分的回归，大约一半的组织在使用性别拆分数据集时实现了时钟性能的改进。BayesAge 2.0的特征选择策略可能使其对任一性别独有的年龄变化更敏感。例如，肝脏性别特异性时钟仅在BayesAge 2.0中表现优于性别组合时钟。有趣的是，肝脏性别特异性时钟背后的大多数基因与性别组合时钟的基因不同。鉴于肝脏转录组具有高比例的性别特异性衰老特征，性别拆分肝脏时钟的性能改进可能表明，雄性和雌性之间肝脏衰老的性别异质性在组合时被掩盖了。因此，虽然性别拆分时钟并不总是提高时钟性能，但在特定情况下可以，应该为开发更好的年龄预测模型进行测试。
三种机器学习模型识别每种组织中一组共同的衰老生物标志物基因
他们识别了跨三种性别组合机器学习模型共享的衰老生物标志物基因。通过将有助于最佳BayesAge 2.0时钟的基因与来自弹性网络和基于主成分的回归时钟的前10%基因进行比较，他们发现大脑和肠道组织表现出最高的基因重叠，而脾脏的重叠最低。这些基因的人类直系同源物在功能上相关，可能反映了与衰老相关的关键功能变化。例如，大脑中的几个关键基因，如CENPF、SMC4和RCC2，与细胞分裂调控有关，而DLL1与成体神经干细胞维持有关，这与衰老青鳉大脑神经源性能力降低一致。在肠道中，关键基因与营养感知相关，包括神经内分泌肽PTHLH和G蛋白信号调节因子RGS3。总的来说，构成衰老时钟的基因共享相关功能，指向组织衰老动态的关键调节因子。
转录组衰老时钟可以预测独立衰老数据集中的年龄和青鳉中的年轻化干预措施
为了交叉验证他们的转录组衰老时钟，他们将时钟应用于一个已发表的转录组数据集。
