《GeroScience》：Changes in ApoE and TIMP-1 expression correlate with outer blood-retinal barrier disruption in an in vitro model of retinal aging
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本文针对年龄相关性黄斑变性（AMD）早期机制不清、治疗手段有限的难题，介绍了一项创新性研究。研究人员构建了一种可调控厚度的体外布鲁赫膜模型，模拟其随年龄增长而增厚硬化的过程，并研究了该老化模型对原代猪视网膜色素上皮细胞功能的影响。研究发现，在老化模型上培养的细胞出现了单层完整性降低、RPE下沉积物形成等AMD样病变。尤为重要的是，研究揭示了载脂蛋白E和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1在细胞死亡和沉积物累积之前的过表达，提示二者可能在AMD早期发病机制中扮演关键角色，为未来开发针对早期AMD的干预策略提供了新的潜在靶点。
眼睛是心灵的窗户，但有一类眼病却会悄然侵蚀这扇窗户的“底片”，最终导致中心视力不可逆的丧失，它就是年龄相关性黄斑变性。作为全球老年人失明的主要原因，这种疾病至今仍缺乏有效的早期治疗手段。问题的症结在于，我们对疾病早期如何发生、发展知之甚少。科学家们将目光聚焦于视网膜深处一个名为“视网膜色素上皮”的细胞层及其下方名为“布鲁赫膜”的结构。视网膜色素上皮细胞构成了保护视网膜的“血-视网膜外屏障”，而其下方的布鲁赫膜会像水管内壁结垢一样，随着年龄增长自然增厚、硬化。这种增厚被认为是导致视网膜色素上皮功能紊乱和年龄相关性黄斑变性进展的关键因素。然而，布鲁赫膜的正常年龄相关性增厚是如何一步步“诱使”视网膜色素上皮细胞走向病变的？这个过程中有哪些分子“信使”在暗中推动？这些问题由于体内研究的复杂性而一直悬而未决。为了解开这个谜团，填补知识空白，并最终为早期干预找到新靶点，研究人员开展了一项创新的体外模拟研究。
本研究主要运用了以下几项关键技术：首先，研究人员利用不同浓度的八目鳗中间丝α蛋白溶液，制备了可调控厚度的合成布鲁赫膜模型，包括标准厚度、增厚和超增厚三种类型，以模拟不同老化程度。其次，研究使用了原代猪视网膜色素上皮细胞作为模型细胞。核心的表征与检测技术包括：通过跨上皮电阻测量评估细胞单层屏障完整性；使用免疫细胞化学技术对细胞连接蛋白ZO-1和载脂蛋白E进行共定位可视化分析；通过酶联免疫吸附测定检测细胞分泌的多种血管生成相关因子（如VEGF、Ang-2、TIMP-1）的表达水平；并利用MTT法检测细胞活性。
结果
调整蛋白质浓度可制备增厚的八目鳗膜
通过将八目鳗中间丝α溶解于甲酸中，并配制成0.5%、0.75%和1%三种重量体积浓度的溶液，成功制备了标准、增厚和超增厚三种八目鳗膜，其厚度分别约为5微米、10微米和15微米，以模拟健康、老龄和极端老化的布鲁赫膜状态。
在超增厚膜上培养的细胞会发生脱落并形成RPE下沉积物
在长达数周的培养过程中，在标准膜上培养的细胞能保持完整、健康的单层形态。而在增厚和超增厚膜上培养的细胞，则在培养早期（约7天）在单层中形成了圆顶状结构，这些圆顶最终消失，并在后期对应出现了细胞死亡区域。在超增厚膜上培养超过3周后，细胞开始出现死亡和从膜上脱落的现象。
膜厚度不影响视网膜色素上皮细胞的形态和连接长度
经过3周培养后，对在不同厚度膜上生长的细胞进行图像分析，发现其形态参数、连接长度等指标均无显著差异，表明在培养期内，单纯的膜增厚并未影响细胞的基本形态。
在超增厚膜上培养的细胞活力降低
通过MTT活性检测发现，在出现任何可见的单层破坏之前，培养在超增厚膜上的细胞活力就已显著低于培养在标准膜和增厚膜上的细胞，这表明细胞活力的下降先于形态学的明显改变。
ApoE的积聚与ZO-1表达破坏及单层降解相关
免疫细胞化学染色显示，在标准膜上，细胞具有健康的形态，且ZO-1和ApoE表达均一。而在超增厚膜上，虽然明场下细胞单层看起来一致，但可观察到ApoE在某些区域积聚，并且这些区域附近的ZO-1连接蛋白表达出现紊乱和定位破坏。这表明ApoE的异常积聚与血-视网膜外屏障完整性的早期破坏在空间上相关联。
单层完整性在细胞死亡前可量化地降低
跨上皮电阻测量是量化细胞屏障功能的金标准。研究发现，在长达5周的培养中，生长在标准膜上的细胞单层电阻值保持稳定，表明屏障功能完好。而生长在增厚和超增厚膜上的细胞，在形成成熟单层后，其电阻值会显著下降。特别是在超增厚膜上，50%的样本在培养14天内就出现了电阻下降，这定量地证明了布鲁赫膜增厚会直接导致视网膜色素上皮屏障功能的损害，且这种损害发生在可见的细胞死亡之前。
TIMP-1的表达与ApoE积聚和单层降解同时增加
通过检测细胞培养上清液中的血管生成相关因子，研究人员发现，血管内皮生长因子和血管生成素-2的表达在不同膜之间无显著差异，且随时间呈下降趋势。然而，在超增厚膜上培养的细胞，其顶端分泌的基质金属蛋白酶组织抑制剂-1的水平在第17天出现了一个显著的瞬时升高，随后在第21天下降。这一表达峰的出现时间与观察到的ApoE积聚和单层完整性下降的时间点相吻合。
结论与讨论
本研究成功利用可调厚度的八目鳗膜模型，模拟了布鲁赫膜随年龄增长而增厚的过程，并系统研究了这种“老化”的基底膜对视网膜色素上皮细胞的影响。结论指出，布鲁赫膜的增厚本身足以在体外诱导出包括RPE下单层完整性破坏、类玻璃膜疣沉积物形成、细胞活力下降乃至最终死亡等一系列与年龄相关性黄斑变性相似的病理变化。这强有力地证明了布鲁赫膜的年龄相关性改变是驱动年龄相关性黄斑变性发病的关键因素。
研究的核心发现揭示了两个可能在该病早期发病机制中扮演关键角色的分子：载脂蛋白E和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1。研究表明，在沉积物积累和细胞死亡发生之前，载脂蛋白E就已经出现过表达，并且其积聚区域与紧密连接蛋白ZO-1的表达破坏区域相对应。这提示载脂蛋白E的异常代谢可能与血-视网膜外屏障的早期破坏存在因果关系，这一发现与阿尔茨海默病中载脂蛋白E影响血脑屏障通透性的机制有相似之处，为理解不同年龄相关性疾病的共同病理机制提供了线索。另一方面，基质金属蛋白酶组织抑制剂-1的瞬时过表达先于细胞死亡，且与单层破坏同步，提示其可能是连接布鲁赫膜改变与后续细胞事件的重要信号分子。基质金属蛋白酶组织抑制剂-1通常与基质金属蛋白酶共同调节细胞外基质平衡，其在早期年龄相关性黄斑变性模型中的动态变化，可能反映了细胞对异常基底膜的一种代偿或应激反应。
本研究的重大意义在于，它创建了一个高度可控且能模拟关键老化特征的体外研究平台，首次在单一变量下系统揭示了布鲁赫膜增厚如何逐步引发视网膜色素上皮细胞的AMD样病变。这不仅加深了我们对年龄相关性黄斑变性早期、可干预阶段分子机制的理解，更重要的是，将载脂蛋白E和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1推到了舞台中央，将其确立为未来开发早期诊断生物标志物和新型治疗策略的极具潜力的靶点。这项发表在《GeroScience》上的工作，为攻克这一致盲性眼病带来了新的曙光。
