《Nature Communications》：HIV-seq reveals gene expression differences between HIV-transcribing cells from viremic and suppressed people with HIV
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本研究针对ART（抗逆转录病毒疗法）抑制的HIV感染者中，低丰度、非多聚腺苷酸化的HIV转录细胞难以通过常规单细胞RNA测序（scRNA-seq）检测的难题，开发了名为“HIV-seq”的新方法。通过在scRNA-seq中引入靶向HIV保守区的捕获序列，研究人员成功提升了HIV RNA+细胞的检出率与转录本读数，并首次系统比较了病毒血症期与ART抑制期HIV转录细胞的转录组特征。研究发现，两时期的HIV RNA+细胞均富集于效应记忆T细胞（Tem），但病毒血症期细胞呈现细胞毒性特征，而抑制期细胞则表现出独特的抗炎特征，涉及TGF-β信号上调与IFN信号减弱。该研究证明了HIV-seq是深入理解ART期间HIV转录细胞持续存在机制的有效工具，为靶向“活跃病毒库”的治愈策略提供了新见解。
尽管抗逆转录病毒疗法（ART）能有效抑制HIV感染者体内的病毒复制，但一旦停药，病毒通常会在几周内反弹。这提示存在一个具有反弹能力的病毒库，其中不仅包括转录沉默的潜伏感染细胞，也包含那些仍在“活跃”地转录HIV RNA的细胞。这些“活跃”的病毒库细胞被认为在ART期间通过表达病毒产物来加剧慢性炎症，并可能在停药后直接导致病毒反弹。然而，由于这些细胞数量稀少，且其HIV转录本通常未被多聚腺苷酸化，用传统的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对它们进行深入研究一直非常困难。这就引出了几个关键问题：在病毒被药物成功抑制后，这些仍在“说话”的HIV感染细胞究竟藏身何处？它们与未经治疗、病毒大量复制时期的感染细胞有什么不同？理解这些差异，对于开发针对性的清除策略，最终实现HIV治愈至关重要。
为了回答这些问题，一支研究团队开发了一种名为“HIV-seq”的新方法，并成功对病毒血症期和ART抑制期HIV感染者血液中的HIV转录细胞进行了首次深入的对比研究。他们的研究成果发表在《自然-通讯》（Nature Communications）上。
研究人员运用了几个关键技术方法：首先，他们创建了“HIV-seq”，这是一种改良的、与10x Genomics平台兼容的5‘端scRNA-seq工作流程。其核心是在标准的poly-dT引物中，额外加入了多个靶向HIV基因组不同保守区域（如R-U5-pre-gag、pol、tat-rev第二外显子等）的特异性逆转录引物，以增强对非多聚腺苷酸化HIV转录本的捕获能力。其次，他们在protocol中整合了CITE-seq（通过转录组和表位组同时检测细胞），利用DNA条形码标记的抗体对细胞进行深入表型分析。研究队列包括4名未接受ART的病毒血症期HIV感染者和其中3名在接受ART超过24周达到病毒抑制后的配对样本。
HIV-seq增强了对HIV转录细胞和转录本的检测
研究人员首先验证了HIV-seq的有效性。与标准的5‘ scRNA-seq相比，HIV-seq在不影响宿主转录组分析的前提下，从病毒血症期感染者样本中检测到的平均每个细胞的HIV读段数增加了一倍，并且增加了可分析的HIV RNA+细胞的数量。重要的是，在HIV未感染者的细胞中未检测到背景信号，证实了该方法的特异性。这些结果表明，HIV-seq能更有效地捕获和研究稀少的HIV转录细胞。
病毒血症期HIV RNA+细胞主要是具有细胞毒性特征的Tem细胞，并呈现利于HIV复制的细胞内状态
利用HIV-seq，研究人员从4名病毒血症期感染者中鉴定出总计1072个HIV RNA+ CD4+T细胞。分析发现，这些细胞并非随机分布，而是显著富集于效应记忆T细胞（Tem）亚群中。与未感染的CD4+T细胞相比，HIV RNA+细胞表现出独特的基因表达特征：它们下调了中央记忆T细胞（Tcm）的标志物（如CCR7、SELL），也下调了包括APOBEC3A、SERPINA1和CST3在内的多种抗病毒因子和蛋白酶抑制剂的表达，提示其细胞内环境可能更有利于病毒复制。同时，它们上调了激活标志物CD70和替代辅助受体CXCR6。通路分析显示，NFAT（活化T细胞核因子）和PKC（蛋白激酶C）等促进HIV转录的信号通路被激活。聚类分析进一步揭示，超过三分之一的HIV RNA+细胞集中在一个具有Th1样细胞毒性特征的细胞簇中，该簇高表达颗粒酶（GZMA, GZMB等）、穿孔素（PRF1）、颗粒溶素（GNLY）以及IFN-γ和TBX21。
ART抑制期HIV RNA+细胞主要为Tem细胞但不具细胞毒性特征，且表现出干细胞样特性
在3名达到ART抑制的感染者配对样本中，研究人员鉴定出25个HIV RNA+细胞。与病毒血症期类似，这些细胞也主要富集于Tem细胞。然而，与病毒血症期形成鲜明对比的是，这些细胞并未富集于前述的细胞毒性细胞簇。相反，超过一半的HIV RNA+细胞分布在两个高表达白细胞介素7受体（IL7R/CD127）的细胞簇中，该受体是细胞长期存活和稳态增殖的关键驱动因子。直接比较也证实，抑制期的HIV RNA+细胞其IL7R的转录本和蛋白水平均显著高于未感染细胞。此外，44%的抑制期HIV RNA+细胞表达抗凋亡基因BCL-2。这些特征共同指向，在ART抑制背景下，持续存在的HIV转录细胞更具干细胞样或长期存活细胞的表型。
HIV RNA+细胞的转录特征在病毒血症期与ART抑制期存在显著差异
对配对样本的HIV RNA+细胞进行直接比较发现，两者存在明显不同的分子特征。病毒血症期的细胞高表达一系列干扰素刺激基因（ISG），如IFI27、ISG15、MX1等，以及促炎基因，显示出强烈的抗病毒和炎症状态。此外，它们也高表达SRRM1（一种HIV剪接调节因子），而低表达RBL2和RPS10（两者均与抑制HIV转录/翻译有关）。通路分析证实，病毒血症期细胞的I型和II型干扰素信号通路显著上调。相反，ART抑制期的HIV RNA+细胞则表现出转化生长因子β（TGF-β）信号通路上调的特征。这些发现表明，ART不仅抑制了病毒复制，也深刻改变了存活下来的HIV转录细胞的免疫微环境和细胞内在状态。
总CD4+T细胞在病毒血症期展现出更强的抗病毒免疫和整合应激反应
研究人员还比较了病毒血症期与抑制期总CD4+T细胞的转录组。尽管细胞亚群分布相似，但整体转录谱存在差异。病毒血症期的CD4+T细胞高表达ISG、促炎细胞因子（如IL6）和细胞毒性分子（如GZMB, GZMK）。尤为重要的是，它们上调了EIF2AK2（编码PKR蛋白）的表达，并伴随多种核糖体蛋白基因的下调，这提示整合应激反应（ISR）通路在病毒血症期被激活。ISR通常是对细胞应激（包括病毒感染）的反应，通过抑制全局蛋白质合成来限制病毒传播。
研究结论与意义
本研究通过开发并应用HIV-seq技术，首次实现了对ART抑制期HIV感染者外周血中HIV转录细胞的系统性单细胞转录组分析，并完成了与病毒血症期细胞的直接对比。主要结论包括：1. HIV-seq能有效提高对HIV转录本和转录细胞的检测能力，是研究病毒库的有力新工具。2. 无论在病毒血症期还是ART抑制期，HIV转录细胞都主要富集于效应记忆T细胞（Tem）亚群。3. 两时期的HIV转录细胞存在本质差异：病毒血症期细胞具有强烈的细胞毒性和炎症/抗病毒状态，而ART抑制期细胞则失去了细胞毒性，转而表现出与长期存活、稳态增殖相关的干细胞样特征（如高表达IL7R、BCL-2），并伴有独特的抗炎性TGF-β信号上调。4. 整体CD4+T细胞在病毒血症期处于一个激活的抗病毒和应激状态。
这项研究具有重要意义。它澄清了关于“活跃病毒库”细胞特征的一个关键问题：ART抑制期持续存在的HIV转录细胞，并非简单延续了病毒血症期感染细胞的特性。它们为了在药物压力和免疫监视下长期存活，可能进化或选择出了一套独特的生存策略。这提示，针对病毒血症期感染细胞设计的干预措施（如基于细胞毒性特征的清除策略），可能对抑制期的潜伏病毒库效果有限。研究指出，靶向IL-7/IL7R信号轴或BCL-2等促生存通路，或许是清除这些长期存活病毒库细胞的新方向。同时，抑制期细胞特有的TGF-β信号上调，也为理解HIV潜伏的免疫调控机制提供了新线索。总之，该研究为更精准地靶向HIV病毒库，最终实现功能性治愈或根治，提供了重要的新见解和潜在的新靶点。
