《Applied and Environmental Microbiology》：Role of sucrose-dependent exopolysaccharides in the biofilm development of Streptococcus mutans revealed at the microscale level
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本综述通过单细胞追踪与荧光染色技术，在微观尺度上系统揭示了蔗糖依赖性胞外多糖（EPS，主要为葡聚糖）如何作为动态支架，双重调控变形链球菌生物膜发育的机制：其一，机械性加速生物膜组装，即增强细菌表面粘附、诱导细胞链弯曲成簇、促进微菌落从2D向3D结构快速转变；其二，促进行生，即通过形成底部液态区域，导致生物膜内部结构（如液区形成）与酸碱度（pH）异质性，为龋齿脱矿创造关键微环境，为靶向EPS的新型抗龋策略提供了新的见解。
蔗糖依赖性胞外多糖在微观尺度调控变形链球菌生物膜发育的机制
摘要
1变形链球菌因能快速代谢蔗糖产生胞外多糖而成为龋病主要致病菌。先前研究多聚焦于宏观或分子层面，而EPS在微观尺度上调控生物膜形成的机制尚不清晰。本研究结合细菌追踪与荧光染色技术，在微观尺度揭示了蔗糖依赖性EPS在野生型与ΔgtfB突变株生物膜发育中的双重功能：它作为动态支架，一方面机械性加速生物膜组装，另一方面促进生物膜内部结构与pH异质性的形成，从而为釉质脱矿创造条件，为开发新型抗龋策略提供了新见解。
引言
龋齿是最常见的口腔感染性疾病之一，其发病与牙菌斑生物膜密切相关，其中变形链球菌扮演关键角色。其致病力很大程度上归因于利用蔗糖的能力：一是通过葡糖基转移酶合成葡聚糖，促进初始粘附并构建生物膜支架；二是发酵蔗糖产酸且耐酸。这些特性共同创造了富含葡聚糖的酸性微环境，促进釉质脱矿物质。作为关键基质成分，蔗糖来源的EPS通过改变物理生化特性决定生物膜致病性。然而，以往研究多在分子或宏观层面，直接从微观尺度阐明EPS如何调控变形链球菌生物膜的研究仍然有限。
结果
蔗糖在生物膜发育早期增强变形链球菌表面粘附并改变其微菌落结构
为探究EPS如何影响生物膜形成，研究首先在微观尺度检测了不同蔗糖浓度下野生型细胞的表面粘附。结果表明，细胞粘附率从无蔗糖培养基的1.1%显著增加至1%蔗糖时的5.9%，且该效应在超过1%后趋于饱和。粘附后，细胞生长模式因蔗糖存在与否而显著不同：无蔗糖时，WT细胞链沿体轴持续生长，形成一维长链；而在含1%蔗糖的培养基中，子代细胞生长方向常明显偏离母细胞体轴，导致形成二维花状细胞簇。通过构建ΔgtfB突变株进行验证，发现其在1%蔗糖中表现出与WT在无蔗糖中相似的生长模式，证实了该蔗糖依赖性行为是通过合成葡聚糖介导的。
为定量表征链形态差异，研究测量了生长3小时后相邻细胞间的弯曲角。结果显示，WT细胞在1%蔗糖中的平均弯曲角显著小于其他条件，表明葡聚糖存在促进了细胞链的弯曲，导致观测到的致密花状簇集。定量分析6小时微菌落的填充比发现，WT在1%蔗糖中的平均填充比高达82%，远高于无蔗糖或其他条件下的约14%，说明EPS促使细胞紧密堆积。此外，测量浮游细胞链的持续长度发现，在1%蔗糖中培养的链其持续长度显著更长，表明EPS使浮游细胞链刚性增强，这种刚性链与表面的相互作用驱动了观测到的弯曲和致密簇集。
蔗糖显著影响微菌落生长的2D-3D转变时间及成熟生物膜形态
在蔗糖存在下，变形链球菌微菌落经历了从单层到多层结构的明显转变。研究定义了2D-3D转变时间点，并发现转变时间与蔗糖浓度呈非线性关系，在1%蔗糖时达到最短。当3D微菌落成熟后，在测试的蔗糖浓度范围内均会形成致密生物膜，但定量表征显示，不同蔗糖浓度下形成的生物膜其面积和厚度存在差异。生物膜的厚度和面积均在1%蔗糖时达到最大值，表明存在一个最佳的蔗糖浓度用于变形链球菌生物膜形成。结合转变时间与最终生物膜属性的结果来看，2D-3D转变时间与成熟生物膜性质呈负相关。
葡聚糖产生的动态测量揭示了其与变形链球菌表型观察的相关性
为阐明表型背后的机制，研究利用荧光标记的葡聚糖探针原位标记新合成的葡聚糖。结果显示，在粘附过程初期，葡聚糖信号与附着细胞共定位，支持了EPS在表面粘附中的作用。随时间推移，在细胞间隔处出现离散的荧光斑块，形成“竹节状”模式。这些离散的竹节状斑块有助于将整个细菌链牢固锚定在表面。随着细胞继续生长和分裂，荧光区域围绕细胞扩展，总荧光强度也增加，表明葡聚糖持续产生和积累。相应地，被锚定的链开始在细胞连接处弯曲，这与先前的弯曲分析一致。
对不同蔗糖浓度下葡聚糖产生动力学的测量显示，所有结果呈现相似趋势，即荧光强度随时间增加。特别是在9至12小时期间荧光强度急剧上升。定量上，同一时间段产生的葡聚糖量与蔗糖浓度呈非线性关系，在1%蔗糖时达到最大。在更发达的20小时生物膜中也观察到类似的蔗糖浓度依赖趋势。通过监测ΔgtfB突变株的EPS产生，发现gtfB基因的缺失显著损害了细菌产生足够葡聚糖的能力，典型的竹节状EPS分布不再被观察到，荧光强度相比WT大幅降低。这些结果支持了由GtfB合成的水不溶性葡聚糖在观测到的生物膜发育过程中扮演重要角色。
生物膜的微观尺度追踪揭示了内部异质结构及其相关pH分布的演变
研究在最佳蔗糖条件下监测了变形链球菌整个生物膜发育过程中的结构动力学。过程遵循生物膜发育的常见阶段：初始粘附、微菌落形成及后期更发达的3D菌落。研究捕捉到了对结构异质性至关重要的新事件：当相邻微菌落接触并继续扩张时，强烈的EPS介导的内聚力及其对基质的粘附会导致明显的不稳定性，进一步扩张会诱导屈曲，在菌落相遇处形成隆起。随着两个相邻菌落逐渐向上抬起形成隆起，菌落与基质之间的空间形成了被合并菌落包围的液态区域。
有数条证据支持该封闭区域是类液体的。首先，共聚焦扫描图像显示生物膜底部存在一个既不包含EPS也不包含细菌细胞的清晰空隙。其次，在这些区域中观察到浮游细胞进行着扩散类型的运动。通过计算均方位移，并拟合对数图中的MSD曲线，得到的斜率小于1，表明这些液态区域中的细菌细胞进行着类似亚扩散的运动。
EPS基质作为扩散屏障，限制了带电离子的渗透，这会导致生物膜中pH的异质分布。研究假设液态区域的pH与其周围菌落区域不同，并通过使用比率计量染料原位测量pH进行了验证。结果显示，液态区域的R/B比值低于其周围菌落区域，即pH更高。对于更长的孵育时间，两个区域的R/B比值均增加，但液态区域R/B比值低于周围菌落区域的趋势保持不变。考虑到微菌落内的扩散屏障，pH在微菌落内也可能非均匀分布。因此，研究进一步测量了从封闭液态区域底部一直到周围菌落区域顶部沿垂直方向的pH分布。结果显示，在液态区域内，pH变化不大；然而，在菌落区域内，标准化的R/B比值呈现明显的增加趋势，表明菌落从底部到顶部酸性更强。该趋势在更长的孵育时间下更强。通过比较同一生物膜采样区域在12小时和14.5小时测量的所有切片的平均值，也证实了酸度随孵育时间增加。
讨论
本研究通过细菌追踪技术和荧光染色，探究了蔗糖依赖性EPS如何在微观尺度塑造变形链球菌生物膜发育。研究表明，EPS不仅是结构组分，更是动态调节器，主导了生物膜的发育轨迹。具体而言，蔗糖依赖性EPS（i）增强细胞链粘附，（ii）改变浮游细胞链的力学性质，（iii）促进基底锚定细胞链的弯曲和断裂，（iv）加速微菌落生长的2D-3D转变时间，并最终产生结构和化学异质性的空间构型。
在表面粘附阶段，荧光标记显示新产生的葡聚糖在细胞表面形成渐进的、离散的“竹节状”涂层。单细胞链追踪表明，较早附着的细胞有助于链中其他细胞最终实现表面粘附。在微观力学尺度，葡聚糖介导的细胞锚定产生了附着链的独特生长模式。当细胞分裂时，葡聚糖介导的固定将轴向生长转化为机械应力，诱导细胞连接处的屈曲和弯曲。这种生长诱导的变形是打破线性链并启动致密多层簇形成的关键微观机制，为3D发育奠定了基础。
本研究的一个关键定量发现是证明了EPS积极加速了微菌落的2D-3D转变。由GtfB在表面形成的葡聚糖含有更多3-连接的葡萄糖和更多分支点，这使得它们高度不溶且结构刚硬，可促进微菌落的垂直生长。最直接的证据是“液态区域”的形成。研究提出，不溶性葡聚糖的丰度不仅提供了支架，还产生了内部机械应力，主动将生物膜向上推。珠子追踪实验证实这些空隙源于屈曲不稳定性。EPS的强粘附力与生长中微菌落的外向压力相结合，诱导屈曲，在相邻菌落相遇处形成隆起和封闭的液态区域。
EPS的空间组织也主导了化学微环境，导致显著的pH异质性。测量到了明显的pH异质性，生物膜底部的封闭液态区域持续比周围的细胞基质区域酸性更低，而细胞基质区域显示出从底部到顶部酸度增加。研究将此垂直梯度归因于三个因素：（i）连续的营养流维持了微菌落顶部的较高代谢活性；（ii）底部的封闭液态区域充当稀释储存库，缓冲质子的积累；（iii）EPS介导的基质孔隙率/水合差异改变了局部质子的扩散。细胞基质区域和液态区域的pH值均远低于牙釉质开始脱矿的临界pH，但它们对蛀牙的影响可能不同。细胞基质区域可能截留离子以促进再矿化，而液态区域允许不受限制的离子扩散，可能稀释溶解的矿物质并阻碍再矿化。
此外，液态区域还可能作为生物膜内物质高效交换的流动通道。同时，最近的研究表明，EPS基质可产生渗透压，诱导生物膜底部吸水，驱动局部膨胀和细菌微聚集体向新的表面位置迁移。这些机制揭示了EPS介导的液态区域复杂的功能角色。本研究使用了单物种模型，未能捕获牙菌斑中存在的种间EPS消耗、基质重塑或竞争。在多种物种生物膜中，变形链球菌产生的EPS可能被邻近物种代谢或降解，或作为有利于多个类群的共享支架，或被替代基质组分竞争性取代。这些相互作用都可能显著改变微菌落的2D-3D转变和封闭液态区域的持久性。
结论
通过运用细菌追踪和荧光染色技术，本研究在微观尺度揭示了蔗糖依赖性EPS在变形链球菌生物膜发育不同阶段的作用。结果表明，EPS通过增强细胞表面粘附、形成致密簇、加速微菌落的2D-3D转变以及影响成熟生物膜的最终形态来调节生物膜发育。此外，通过监测生物膜的微观发育，研究清晰地展示了液态区域的起源及其与生物膜结构和pH异质性的相关性。这些微观尺度的动态见解将有助于搭建从简化模型到复杂牙菌斑生态学的机制理解桥梁，为开发基于EPS的龋齿控制新方法提供有价值的见解。
材料与方法
本研究使用了变形链球菌ATCC 25175和大肠杆菌DH5α。通过同源重组构建了ΔgtfB突变株。生物膜在流通池中形成，并利用荧光标记（如Alexa Fluor 488标记的葡聚糖偶联物标记EPS，FM4-64标记细胞膜）和比率计量pH探针进行染色和测量。图像采集使用显微镜和共聚焦显微镜，图像处理和分析使用ImageJ、MATLAB等软件进行定量，包括粘附率、弯曲角、填充比、持续长度、2D-3D转变时间、生物膜面积与厚度、荧光强度以及均方位移等计算。
