通过喹啉肼衍生物化方法对N-糖链进行的高灵敏度分析

《Analytica Chimica Acta》：Highly Sensitive Analysis of N-Glycans via Derivatization with Quinoline Hydrazide Reagents

血清N-糖蛋白检测灵敏度提升研究。合成五种水溶性淬灭剂用于糖基化修饰，显著增强LC-ESI-MS检测灵敏度达32倍，使58种糖蛋白可检测，并发现H4N3F1等肺癌特异性生物标志物。

　　

Jian Fei|Wei Du|Xin Liu

中国教育部生物医学光子学重点实验室，位于武汉国家光电子实验室——湖北生物信息学与分子成像重点实验室，系统生物学主题，华中科技大学生命科学技术学院生物医学工程系，武汉430074，中国

摘要

背景

异常的血清N-糖链与多种疾病相关，为早期诊断提供了潜力。然而，糖链缺乏易于电离的基团，且其高亲水性进一步阻碍了离子的形成，导致质谱检测灵敏度较低。为了解决这个问题，我们合成了五种疏水性喹啉肼试剂，用于N-糖链的衍生化，旨在提高质谱性能。本研究评估了这些试剂的衍生化效率和灵敏度提升效果，重点关注其在人类血清糖组学分析中的应用，以发现疾病生物标志物。

结果

与未衍生化的糖链相比，所有五种喹啉肼试剂在LC-ESI-MS中的 maltotetraose (DP7) 检测灵敏度提高了20倍以上。其中最有效的试剂2-甲基-6-甲氧基-4-喹啉肼 (MMQCH) 将灵敏度提高了32倍。当应用于人类血清N-糖链时，MMQCH衍生化显著将可检测的糖链种类从19种增加到58种。对肺癌患者和健康对照组的血清进行比较分析，发现了几种差异表达的糖链生物标志物，如H4N3F1，具有高度统计显著性（p < 0.0001）。这些发现表明，基于喹啉肼的衍生化显著提高了糖链的检测灵敏度，并能够识别临床样本中的潜在诊断标志物。

意义

本研究介绍了一种使用喹啉肼试剂的有效衍生化策略，显著提高了质谱中N-糖链的检测灵敏度。改进的方法有助于发现具有临床意义的糖链生物标志物，支持早期疾病诊断。这些发现推动了糖组学分析的发展，并为基于血清N-糖链谱型的非侵入性诊断检测提供了实用工具。

引言

糖基化是蛋白质的重要翻译后修饰过程，在癌症和糖尿病等多种重大疾病的发病机制中起着关键作用[1]、[2]。大量研究表明，这些疾病状态通常伴随着细胞表面或分泌蛋白上糖链结构的异常变化。例如，在卵巢癌的发展过程中，糖链结构的变化（如过度唾液酸化和岩藻糖基化）已被证实起着重要作用[3]。因此，建立高效灵敏的血清糖链分析方法对于进一步阐明糖链在生物过程中的作用至关重要。此外，这些方法对于发现和验证疾病诊断和预后评估的生物标志物也非常重要。

质谱（MS）技术由于其出色的灵敏度、检测低丰度糖链的能力以及解析复杂结构异构体的能力，已成为糖组学领域的基石。在各种质谱平台中，基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）是糖组学分析中最广泛使用的技术。MALDI-MS在糖组学谱型分析中具有显著优势，如对盐和洗涤剂的强耐受性、样品制备简单、光谱分析方便以及高通量。然而，MALDI-MS中基质的不均匀结晶导致电离效率不稳定，影响检测灵敏度的稳定性和重复性[4]、[5]、[6]、[7]。相比之下，ESI-MS是一种液相电离技术，可以无缝与高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）等分离技术结合，非常适合复杂混合物的自动化分析。ESI-MS的检测精度和准确性通常优于MALDI-MS[8]、[9]、[10]、[11]。LC-ESI-MS的结合将液相色谱的高效分离能力与质谱的高精度检测相结合，有效分离糖链的结构异构体，并获得准确的分子量和碎片离子信息，从而实现对复杂生物样本中N-糖链的高灵敏度、高精度定性和定量分析[12]、[13]。

糖链缺乏肽和核酸中常见的易于电离的功能基团。它们的高亲水性还会促进氢键网络的形成，阻碍气相中的有效离子形成。因此，化学衍生化被广泛用于提高ESI-MS分析中的电离效率[9]、[14]、[15]。常见的衍生化方法包括甲基化[16]、[17]、还原胺化[18]、[19]和肼化[20]、[21]。然而，甲基化需要强碱性条件，可能导致糖苷键断裂和单糖丢失。还原胺化涉及复杂的过程，需要还原剂，并可能在纯化过程中导致样品损失。相比之下，基于肼的化学标记可以在温和条件下与还原性糖链反应生成稳定的腙产物，无需还原剂或后续纯化步骤。常用的肼化试剂包括Girard’s T (GT)[22]、Girard’s P (GP)[23]和苯肼 (PHN)[24]。一些传统的基于肼的标记协议需要在酸性条件下长时间反应并加热，这可能损害唾液酸残基的结构完整性。相比之下，最近的方法展示了更温和和更快的标记策略。尽管如此，许多方法仍然需要额外的步骤。因此，开发能够在温和条件下快速一步完成衍生化的试剂仍然非常受欢迎。基于肼的标记的最新进展扩展了糖链分析的工具箱。Lu等人（2024年）使用Girard’s P进行稳定同位素标记，实现了定量糖组学[25]；Zhang等人（2020年）引入了一种用于MALDI-MS的阳离子肼标签，实现了显著的信号增强[4]。Fei等人（2025年）使用多重MALDI-MS分析证明了同位素编码的肼标签的定量糖组学能力[26]。尽管有这些进展，但基于喹啉的肼试剂——结合了强疏水核心和反应性的肼基团——尚未系统地用于LC-ESI-MS分析N-糖链，这激发了本研究。

先前的研究表明，基于喹啉的肼试剂能够高灵敏度检测小分子（如人类血清中的脂肪胺），以及快速衍生化和高度灵敏地分析大分子结构（如糖链[27]、[28]。喹啉部分作为一种强疏水芳香杂环，显著提高了糖链分子的整体疏水性，从而显著改善了它们的色谱分离性能。到目前为止，尚未有报道使用基于喹啉的肼试剂进行LC-ESI-MS分析糖链的应用。

在这项研究中，我们设计并合成了几种喹啉肼试剂，并系统研究了不同取代基对其与N-糖链反应性的影响，以及这些试剂对衍生化糖链的LC-ESI-MS检测性能的影响。使用最佳试剂MMQCH，在温和条件下30分钟内即可完成糖链的完全衍生化。与未衍生化的N-糖链相比，MMQCH衍生的血清糖链表现出显著的灵敏度提升，并能够识别多种糖链结构。结合LC-ESI-MS分析平台，该方法被用于分析肺癌患者的血清N-糖链。健康对照组和不同阶段肺癌样本之间的比较分析揭示了多种显著改变的N-糖链，证明了该策略在发现疾病相关糖链生物标志物和提供早期癌症诊断的新技术支持方面的实用性。

化学物质和材料

化合物合成所需的试剂具有化学纯度，TLC分析是在硅胶GF254上进行的。四氢呋喃（THF）购自Merck KgaA（德国达姆施塔特），所有水溶液均使用Milli-Q纯化系统（Millipore，马萨诸塞州贝德福德）纯化的水制备。获得了苯胺、对甲苯胺、4-氯苯胺、4-溴苯胺、对茴香胺盐酸盐、硫酸钠、氢氧化钾、乙腈、二氯甲烷和乙醚

有机合成

五种喹啉肼衍生物的合成按照方案1进行。目标化合物是从带有相应取代基（R1-R5）的对甲苯胺衍生物通过四步反应序列（a-d）合成的，得到了用于LC-ESI-MS分析的具有不同取代基（-H、-CH3、-OMe、-Cl、-Br）的喹啉肼衍生物。最初，对甲苯胺经过反应a得到4-甲基异嗪作为关键中间体。随后的Pfitzinger反应（b）

结论

在这项研究中，我们成功开发了一种基于喹啉肼试剂的N-糖链衍生化方法。其中，MMQCH试剂表现出最佳性能，在温和条件下快速完成反应，并将模型糖链DP7的LC-ESI-MS检测灵敏度提高了32倍。当应用于人类血清分析时，该方法显著将可识别的N-糖链种类从19种增加到58种。在肺癌研究中

CRediT作者贡献声明

Xin Liu：概念化。Jian Fei：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，软件，方法学，研究，形式分析，数据管理。Wei Du：资金获取，概念化

注释

作者声明没有竞争性财务利益。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2022YFC3400800）的资助