《Analytica Chimica Acta》：Environmental microbial bioprospecting enabled by a Raman fingerprinting and functional sorting on a microfluidic static droplet array
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微流控静态液滴阵列结合拉曼光谱指纹分析技术实现单细胞功能筛选，通过优化液滴生成（720滴/3秒）、低功率激发（532nm/5mW）和亚细胞特性分析，建立双生物标志物策略（CDR_cal与拉曼指纹）成功从复杂土壤菌群中分离鉴定6株高效溶磷菌，准确率达97.9%，重建误差低至10^-28，显著优于传统多变量分析，为微生物功能定向筛选提供高效平台。
郑国霞|刘艳文|陈慧成|卢玲|王琳|贾婷婷|王云华
大连大学环境与化学工程学院，中国大连116622
摘要
在当前的单细胞分析技术中，功能驱动的微生物生物勘探一直受到通量、分辨率和细胞存活率之间持续权衡的阻碍。为了克服这些限制，我们开发了MicroSD-RFFS平台，该平台将微流控静态液滴阵列与拉曼光谱指纹识别和功能分选无缝集成。该平台通过刀片辅助的液滴生成技术实现高通量的单细胞封装（约3秒，每个芯片生成720个液滴），在低功率激发（532纳米，5毫瓦，每个细胞5秒）下实现高分辨率的光谱采集，利用基于成本效益高的铝箔芯片的静态液滴阵列，并通过基底诱导的复制镀膜实现与培养兼容的分选。应用于磷溶解细菌（PSB）的筛选时，MicroSD-RFFS采用双重生物标志物策略：利用校准后的C–D带比率（CDRcal）来评估功能活性，并通过拉曼指纹识别菌株。通过集成优化的降维方法（基于排列的奇异值分解（SVD）低秩近似算法）和判别模型，该系统从复杂的土壤群落中高效分离并鉴定了六种PSB菌株，实现了近乎完美的区分概率（最小概率=0.979）和10-26～10-28的数量级重建误差。这些结果与组学数据一致，并显著优于传统的多变量分析方法。它们的功能特征基于CDRcal进行了准确排序，与传统磷溶解活性测定结果一致。因此，MicroSD-RFFS为单细胞水平的功能驱动微生物发现提供了一个高效且稳健的平台和方法。
引言
自然生态系统是地球上最丰富的生物化学创新源泉。特别是微生物系统驱动了全球75%以上的生物地球化学过程，并编码了超过一百万个未表征的生物合成基因簇[1]。这些微观生物工厂已经产生了68%的临床抗生素和45%的抗癌药物，其在可持续农业和环境修复中的应用为应对地球边界挑战提供了变革潜力[2]、[3]。然而，传统的基于培养的方法只能获取大约0.2%的微生物多样性，这突显了生物勘探工作中的技术瓶颈[4]。
理想的微生物生物勘探框架围绕“功能驱动的靶向细胞筛选”展开[5]，这得益于先进单细胞生理分析技术的复杂集成。流式细胞术（FCM）和荧光激活细胞分选（FACS）在高通量微生物筛选和存活率评估方面表现出色[6]、[7]，而单细胞基因组学（scGenomics）提供了无与伦比的遗传分辨率[8]，稳定的同位素探测结合纳米级二次离子质谱（SIP-nano SIMS）能够准确地将微生物身份与生态功能联系起来[9]。然而，这些技术在单细胞信息的粒度或全面性方面存在某些限制[10]。有些方法可能无法完全捕捉亚细胞特征，而其他方法则依赖于扩增，通常涉及标记、裂解或物理扰动[8]、[9]、[10]。这些因素可能阻碍与实时代谢谱分析和后续生理分析的兼容性。
单细胞拉曼光谱（SCRS）有效地弥合了这些差距，成为这一集成框架中的关键组成部分[11]。通过利用拉曼散射效应，SCRS直接探测单个细胞的分子组成，生成包括核酸、蛋白质、脂质、色素和多磷酸盐在内的全面生化谱型，从而在单细胞水平提供详细的生理洞察[12]。此外，其非破坏性特性使其能够与下游应用（如细胞培养和组学分析）无缝集成，从而实现功能筛选、深入表征和验证[13]。拉曼光谱，特别是在指纹区域（600-1800厘米-1），提供了微生物的独特表型“指纹”[14]。当与多变量分析和机器学习结合时，这种方法不仅能够进行分类鉴定（例如，微藻和细菌），还能在亚群之间进行精确区分。例如，对30种细菌病原体分离株（包括葡萄球菌、大肠杆菌和假单胞菌）的菌株水平鉴定准确率超过80%[15]。食源性病原体也在牛奶和肉类等各种食品基质中被成功检测到[16]、[17]。
SCRS还能够根据生理特征区分代谢亚群，并在与SIP结合时追踪代谢通量[18]。使用13C、15N或氘（2H）标记的底物，特别是成本效益高且无毒的重水（D2O）作为通用示踪剂，它可以检测到沉默光谱区域（2040-2300厘米-1）内的C-D键，该区域不受自然背景干扰[18]、[19]。这使得即使是对未标记底物进行吸收的代谢活跃细胞也能被敏感且非破坏性地识别。例如，拉曼-D2O探测方法已被证明能有效识别对膳食糖类有反应的肠道细菌，以及在抗菌治疗下检测抗药性病原体[20]、[21]。尽管取得了这些进展，但将SCRS应用于环境微生物群落仍然具有挑战性，因为难以在微米尺度上实现精确操作和高通量处理细菌细胞[22]。这推动了SCRS与微流控技术的集成，特别是基于微流控液滴的系统，这些系统是处理单个细胞的最先进工具之一[23]。这种集成产生了诸如拉曼激活微流控分选（RAMS）[24]、[25]、拉曼激活液滴分选（RADS）[26]和拉曼激活细胞计数（RACC）[27]等先进系统。然而，当前的方法通常依赖于连续流动的液滴，这限制了光谱采集时间，或者使用如聚二甲基硅氧烷（PDMS）等材料，这些材料会引入强烈的拉曼背景干扰。因此，应用主要限于定量共振拉曼光谱或使用依赖于特定非共振带（如C–D伸缩振动）的拉曼镊子进行有限通量的细胞分选[24]、[25]、[26]、[27]。生物信息丰富的拉曼指纹区域（600-1800厘米-1），尽管编码了来自多种生物分子的高度特异性分子振动，但由于信号较弱、易受干扰以及微生物物种之间的光谱差异微妙，仍然未被充分利用[14]、[15]、[16]、[17]。静态液滴，其中液滴被捕获在微孔中，分布在水相中或沉积在板上以进行长时间观察，可能提供一种替代方案[29]、[30]、[31]。尽管如此，灵活的按需液滴分选和高通量单细胞操作的挑战仍然存在，这突显了需要结合长时间测量能力和多功能流体控制的集成解决方案的必要性。
在这里，我们介绍了一种基于微流控静态液滴的拉曼指纹识别和功能分选系统（MicroSD-RFFS），旨在加速微生物生物勘探。该平台将模块化的微流控静态液滴阵列芯片与共聚焦拉曼显微镜结合。通过优化微孔几何形状和基底特性，实施单次刮擦液滴生成和基于复制镀膜的分选，并微调光谱采集参数，该系统实现了高分辨率的单细胞拉曼谱型和高通量微生物细胞分离。值得注意的是，它保持了细胞存活率，操作简单，并且成本效益高，这些都是微生物发现和功能表征广泛应用的关键特征。
为了展示MicroSD-RFFS的适用性，我们使用该系统筛选了磷溶解细菌（PSB），这些微生物在磷生物地球化学循环中起着关键作用，并且有可能作为生物肥料和生物磷去除过程用于缓解富营养化[32]。通过改进基于拉曼的功能谱型和基于指纹的表型分析策略，我们建立了一个针对环境微生物组的完整MicroSD-RFFS工作流程。直接从复杂的土壤群落中，我们以单细胞分辨率对六种不同的PSB菌株进行了功能表征和定量鉴定，随后在纯培养中分离并进行了针对性分选。因此，MicroSD-RFFS可以作为一种强大且普遍适用的功能驱动微生物生物勘探工具。
部分摘录
MicroSD-RFFS的设计、制造和操作
我们开发了一个名为MicroSD-RFFS的集成平台，用于微生物生物勘探应用（图1）。该系统将一个可插入的微流控静态液滴阵列芯片（MicroSD芯片）与配备Nd:YAG激光器（发射波长为532纳米、633纳米和785纳米）的共聚焦拉曼显微镜（LabRAM Odyssey，HORIBA，日本）结合在一起。MicroSD芯片的设计旨在生成包裹单个细胞的静止液滴，从而实现原位纯培养和分选。
MicroSD-RFFS的整体设计
MicroSD-RFFS系统将可插入的MicroSD风格芯片与拉曼显微镜结合，以实现高通量单细胞封装、光谱谱型和分选。使用简单的刀片刮擦机制，该系统在约3秒内生成720个静态液滴（图S1b，ESI）。采用两个刮擦步骤：第一个步骤实现高效的细胞封装，第二个步骤促进温和的培养基交换，确保高细胞存活率和保留率。这一操作的核心是讨论
理想的微生物生物勘探策略越来越侧重于功能驱动的靶向细胞筛选，这严重依赖于先进的单细胞生理分析。SCRS作为一种强大的工具脱颖而出，能够在单细胞水平实现无标记、非破坏性和高度信息丰富的生理谱型分析[11]、[12]、[13]、[14]。其与微流控技术的集成进一步允许高通量单细胞操作[11]。然而，当前的基于SCRS的微流控系统
CRediT作者贡献声明
卢玲：研究。王琳：验证、资源。贾婷婷：研究。王云华：撰写——审阅与编辑、方法学、概念化。郑国霞：撰写——初稿、方法学、研究、正式分析。刘艳文：研究、正式分析。陈慧成：正式分析、数据管理
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。
致谢
这项工作得到了大连大学（DLUXK-2024-YB-008）的跨学科项目、辽宁省教育厅的基础科学研究项目（LJ222511258008）以及大连大学的金浦学者人才项目的支持。
