《Analytica Chimica Acta》：Dual-layer N-glycoproteomics enhances resolution of serum glycosylation signatures in type 2 diabetes mellitus complicated with coronary heart disease
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双层N-糖基蛋白质组学策略联合位点特异性与完整肽分析，系统解析T2DM合并CHD糖基化重塑，揭示唾液酸/岩藻糖修饰异常及载脂蛋白B关键位点（N185/N1523/N2239/N3411）疾病进展依赖性改变，功能富集显示炎症相关糖基化紊乱介导心血管并发症，与糖基转移酶表达调控网络显著关联。
张赫|陈觉平|陈宇轩|杨子|杨倩|叶本贵|李大鹏|甘伟
四川大学华西医院实验室医学系，成都，610041，中国
摘要
蛋白质糖基化由于其结构异质性，给分析带来了巨大挑战，然而能够在复杂的临床队列中解析糖基位点和糖链水平信息的高效工作流程仍然有限。为了解决这一难题，我们开发了一种集成的双层N-糖蛋白组学策略，该策略结合了高覆盖率的位点特异性N-糖基化分析与完整的N-糖肽分析，以保留糖链特征。2型糖尿病合并冠心病（T2DM&CHD）是一种严重但研究不足的共病现象，而缺乏特征明确的患者队列凸显了我们独特数据集的分析价值。将这一策略应用于健康对照组（n = 43）、2型糖尿病患者（n = 39）、冠心病患者（n = 37）以及2型糖尿病合并冠心病患者（n = 46）的血清样本后，从781个位点特异性N-糖肽中获得了497个N-糖基位点，从341个完整N-糖肽中获得了133个N-糖基位点，展示了这种整合方法所具备的广度和深度。综合分析显示，2型糖尿病合并冠心病患者的糖蛋白组发生了广泛的重塑，其特征是唾液酸化和岩藻糖化改变导致的微异质性增加。载脂蛋白B（APOB）在N185、N1523、N2239和N3411位点的特异性变化表现出与脂质失调和血管损伤相关的阶段依赖性模式。功能富集分析表明，2型糖尿病加剧了与炎症相关的糖基化异常，从而增加了心血管并发症的风险。与糖基转移酶表达的相关性进一步强调了糖链生物合成的调控作用。综上所述，我们的结果为全面的血清糖蛋白组特征分析提供了一个可扩展的分析框架，并为代谢-心血管共病的生物标志物发现提供了机制资源。
引言
2型糖尿病（T2DM）是一个日益严重的全球健康问题，患有T2DM的人患冠心病（CHD）的风险是非糖尿病人群的2-4倍[1]。因此，2型糖尿病合并冠心病（T2DM&CHD）已成为一种常见且高风险的状况，预后较差。这种共病的潜在机制非常复杂，涉及免疫失调、慢性炎症和代谢功能障碍，目前尚未完全阐明[[2], [3], [4], [5]]。尽管现有的生物标志物（如脂质谱）在风险评估中发挥作用，但它们往往缺乏足够的特异性来揭示驱动T2DM&CHD的独特分子机制[6]。因此，迫切需要开发新的分析策略来识别能够反映疾病复杂性的高度特异性分子特征，从而改进风险分层和机制理解[7]。
蛋白质糖基化是一种普遍存在的翻译后修饰，与癌症[8]、免疫障碍[9]和阿尔茨海默病等人类疾病密切相关。先前的研究使用糖组学方法观察了T2DM和CHD患者的整体N-糖链谱的变化[10,11]。一些报告通过分析特定蛋白质（如IgG和AGP）揭示了与疾病风险相关的糖基化修饰[12,13]。然而，由于血清中的蛋白质动态范围极广且糖链异质性极高，直接限制了在蛋白质和位点层面解析糖基化特征的分辨率。这一点至关重要，因为广泛而准确的糖基化位点映射能够提供关于疾病途径的重要机制见解，并有助于发现具有临床意义的药物靶点。
虽然糖组学只能提供总体糖链信息，无法确定哪些蛋白质或位点驱动了这些变化，但位点特异性糖蛋白组学能够同时表征糖基化位点及其连接的糖链，提供了传统方法无法提供的分子机制视角。然而，对于T2DM&CHD等复杂疾病而言，完整的N-糖肽分析仍不够成熟。主要分析障碍包括N-糖肽的低电离效率、广泛的微异质性以及难以分辨结构异构体，这些因素继续限制了血清糖蛋白组学分析的深度和可靠性[14,15]。尽管基于质谱的糖蛋白组学技术取得了显著进展[16]，但同时实现广泛糖基位点覆盖率和准确糖链结构解析的强大策略仍然缺乏，尤其是在需要整合这两层信息的临床队列中。
本研究对包含165个样本的队列进行了系统的血清糖蛋白组学分析，其关键价值在于纳入了临床上罕见的2型糖尿病合并冠心病患者。为了从这一独特资源中获取最大量的信息，我们实施了一种互补的双层策略：首先进行位点特异性的N-糖肽分析以广泛覆盖N-糖基化位点（N-糖基位点），然后进行完整的N-糖肽分析以精确捕获与特定位点相关的完整糖链信息，从而弥补了传统方法中糖链信息的丢失。这种综合分析化学框架使我们不仅能够广泛识别出发生改变的糖基化位点，还能在系统筛查这一罕见共病队列的过程中精确定义它们的分子性质。
材料与试剂
二硫苏糖醇（DTT）和碘乙酰胺（IAA）购自Sigma Aldrich（圣路易斯，密苏里州）。碳酸氢铵（NH4HCO3，>99%）和尿素（UA，>99.5%）购自上海阿拉丁生物科技有限公司。胰蛋白酶（蛋白质组学级）购自Promega（麦迪逊，威斯康星州）。肽-N-糖苷酶F（PNGase F）购自New England Biolabs（伊普斯威奇，马萨诸塞州）。乙腈（ACN，HPLC级）购自GHTECH（广东）。甲酸（FA）和三氟乙酸
研究参与者的临床特征
整个研究设计如图1a所示。在所有被筛选的参与者中，有165人被纳入研究并分为四组：健康对照组（n = 43）、2型糖尿病患者（n = 39）、冠心病患者（n = 37）以及2型糖尿病合并冠心病患者（n = 46）。这种四组队列结构的设计旨在区分单独疾病状态与共病状态的影响。具体来说，CON组与CHD组以及T2DM组与T2DM&CHD组之间的平行比较有助于重点研究预存条件
讨论
为了全面捕捉2型糖尿病合并冠心病（T2DM&CHD）的分子复杂性，我们首次对这一临床罕见的患者队列进行了系统的糖蛋白组学分析。本研究的核心是一种创新的双层策略，它结合了高覆盖率的位点特异性N-糖基化分析与完整的N-糖肽分析。这种方法与Pan等人（2020年）[32]和Shu等人（2020年）[33]的研究结果一致，其关键优势在于同时提供了
结论
总之，我们的集成糖蛋白组学策略结合了位点特异性和完整N-糖肽分析，系统地解码了2型糖尿病合并冠心病（T2DM&CHD）的分子图谱。这种双层方法不仅揭示了疾病特异性的糖基化特征，还在位点占据率和糖链组成维度上展示了卓越的解析能力。我们鉴定了APOB上的关键功能糖基位点（包括N185、N1523等）
CRediT作者贡献声明
张赫：方法学研究、数据整理。陈觉平：撰写——初稿。陈宇轩：撰写——审阅与编辑。杨子：研究。杨倩：研究。叶本贵：资源支持。李大鹏：撰写——审阅与编辑、方法学研究、资金获取、数据整理。甘伟：方法学研究、数据整理。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金青年科学家基金[项目编号82204513]、四川省自然科学基金[项目编号2023NSFSC1673]、教育部和四川省药物靶向与药物递送系统重点实验室创新指导基金[项目编号SCU2023D005]以及四川大学科研启动基金[项目编号YJ202165]的支持。
