用于检测和回收阿托摩尔级分子的纳米限制生物传感器，通过DNA链位移实现

《Biosensors and Bioelectronics》：Nanoconfined biosensor for attomolar molecule detection and recycling via DNA strand displacement

纳米受限DNA链置换反应耦合离子传输调控平台实现attomolar级ATP检测与再生传感，双线性响应机制揭示浓度依赖的传感机理转变，通过固相纳米通道内可编程的DNA置换电路实现多级逻辑信号转换和循环稳定性验证，抗复杂基质干扰性能优异。

　　

陈永欢|岳新茹|龙敏瑞|史月森|刘欣|朱琦|朱江海|于伟华|何子龙|周彪|崔翔|郝新琪|李凤宇

中国广东省化学与材料科学学院，济南大学速度能力研究重点实验室，广州510632

摘要

由于分子碰撞效率低下以及超低浓度下的信号转导能力较弱，实现原子级生物分子检测仍然具有挑战性。在此，我们介绍了一种可回收的纳米限域生物传感平台（ABA@N_CB_S），用于检测三磷酸腺苷（ATP）。该平台将可编程的DNA链置换反应（SDR）直接集成在固态纳米通道中，建立了分子识别与离子传输之间的强耦合。在纳米限域条件下，SDR诱导的DNA构象变化会主动调节通道几何结构和离子迁移路径，将分子识别转化为放大的、可逆的跨膜电流信号。这种限域反应-传输耦合实现了原子级灵敏度（LOD = 83.4 aM），并具有双线性响应特性，反映了不同浓度范围内主导传感机制的转变。此外，级联链置换电路实现了多级逻辑信号转导和传感器的可逆再生。ABA@N_CB_S系统在五个检测-再生循环中表现出稳定的性能，并在复杂的人工汗液基质中具有出色的抗干扰能力。这项工作建立了一种独特的限域反应-传输-逻辑传感范式，超越了传统的纳米限域传感器或基于SDR的可逆系统，为超灵敏生物传感和智能分子信号处理提供了一个多功能平台。

引言

在生物医学和环境监测领域，对超微量生物分子的高灵敏度检测需求日益增加（Fattahi和Hasanzadeh，2022；Li等人，2025；Lu等人，2025）。许多关键疾病生物标志物，如循环肿瘤DNA、早期致病核酸和某些神经递质，在生物流体中的含量极低，通常处于原子级甚至更低的浓度（Tu等人，2025；Peng等人，2026）。传统的检测方法，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）（Naghib等人，2025）和标准荧光传感器（Song等人，2025；Wang等人，2026），其灵敏度通常在皮摩尔到纳摩尔范围内，使得直接检测原子级目标变得非常困难。根本限制在于宏观溶液体积内目标分子与探针分子之间有效碰撞的概率极低，导致信号生成效率低下（Chen等人，2025a；McCann等人，2025；Ivanov等人，2021）。为了克服这一瓶颈，研究人员转向了纳米限域策略（Chen等人，2025a；Su等人，2025；Chen等人，2025b；Huang等人，2023；Chen等人，2025c）。

纳米限域效应指的是在纳米孔、纳米通道或纳米颗粒表面等纳米尺度空间内限制生物传感反应，从而显著增加反应物的局部浓度（Chen等人，2025d；Chen等人，2025e；Chen等人，2025f）。这种限域作用抑制了分子扩散，提高了质量传输效率，从而显著加快了反应动力学并提升了检测灵敏度（Zhu等人，2025；Xue等人，2025）。例如，Jiang等人开发了一种使用DNA三明治结构对固态纳米通道进行功能化的方法，实现了高效的门控控制和灵敏的检测（Jiang等人，2012）。这使得离子流动能够精确调节，开关比达到10⁶，电密封性能达到GΩ级别，最终促成了纳米流体逻辑设备的创建。此外，这些结构的可控组装和拆卸实现了对DNA和三磷酸腺苷（ATP）的“双目标”灵敏检测（Liu等人，2013）。即使在血清等复杂基质中，该系统也保持了高特异性和单碱基错配分辨率。然而，在极低目标浓度下实现稳定和高效的信号转导和再生仍然是该领域的主要挑战。

近年来，基于核酸适配体的生物传感器因其高亲和力、优异的选择性和出色的可编程性而受到广泛关注（Chen等人，2025f；Zhao等人，2025；Zhang等人，2024；Rabiee和Rabiee，2024；Dong等人，2025）。鉴于其日益重要性，适配体技术被国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）评为“2024年十大新兴化学技术”之一（Gomollón-Bel，2024）。在DNA纳米技术中，DNA链置换反应（SDR）作为一种核心机制脱颖而出，基于互补碱基配对原理，具有可编程性、高特异性和可预测的热力学行为（Li等人，2024；Wang等人，2025；Bucci等人，2022）。SDR的引入为构建动态和可调的传感界面提供了一个多功能平台（Zhang等人，2025；Walbrun等人，2024）。通过预先设计的DNA链的可逆杂交和解离，SDR不仅实现了级联信号放大，还实现了可逆响应和可重复使用的传感，从而降低了检测成本并实现了连续监测（Chen等人，2025b；Qian和Winfree，2011；Simmel等人，2019；Zhang等人，2009；Takezawa等人，2023），但这些方法通常在体相溶液中或开放界面实施，其中分子反应与物理信号转导之间的弱耦合限制了超低浓度下的灵敏度和操作稳定性。先前的研究表明，纳米限域传感和DNA SDR都是提高生物传感性能的有效策略，但它们主要沿着独立的研究方向发展。

在这项工作中，我们开发了一种纳米限域生物传感器（N_CB_S），它将SDR的高特异性与纳米尺度空间的限域增强效应相结合，实现了原子级超灵敏的分子检测（图1）。功能性的DNA探针被固定在限域纳米通道空间内（ABA@N_CB_S），有效地富集了目标分子，并放大了目标-探针结合引起的物理信号变化，同时揭示了传感过程的离子依赖性特征（图1A）。限域环境有效屏蔽了来自体相溶液的干扰，从而显著增强了检测响应（图1B和表S1）。关键的是，我们不仅仅是将这两个概念简单结合，而是在固态纳米限域环境中直接嵌入了一个可编程的SDR电路，建立了分子反应动力学与离子传输调节之间的强耦合。这种耦合产生了双线性响应特性，反映了不同浓度范围内主导传感机制的转变，并实现了纳米通道系统内的多级、逻辑控制的信号再生和结构记忆。这种策略引入了一种独特的传感范式，整合了纳米限域、动态DNA反应和离子传输调节，扩展了传统N_CB_S和基于SDR的可逆系统的功能。

材料和试剂

阳极氧化铝（AAO，80?100 nm）膜来自中国合肥普源纳米科技有限公司。ATP结合适配体（ABA，序列：5’-NH₂-(CH₂)₆-CGG CAC CTG GGG GAG TAT TGC GGA GGA AGG TGC CG-3’）（Jiang等人，2012；Liu等人，2013）及其部分互补序列（PCABA）和完全互补序列（CPCABA）由上海Sangon Biotech有限公司定制合成和纯化。本研究中使用的所有其他DNA探针序列

ABA@N_CB_S的制备

使用扫描电子显微镜（SEM）表征了AAO纳米通道膜在表面修饰前后的形态变化。如图2A和表S3所示，原始AAO膜具有平均直径为86.7 ± 0.4 nm的均匀纳米孔阵列。通过硅烷化和Schiff碱反应进行后续表面修饰后，引入了醛基，形成了GA@AAO。平均孔径略有减小，同时

结论

总结来说，我们报告了一种可回收的纳米限域生物传感平台（ABA@N_CB_S），它在固态纳米通道中集成了可编程的DNA链置换反应。通过将目标诱导的DNA构象变化与限域离子传输相结合，该系统实现了原子级ATP检测、多级逻辑调控以及多次循环后的稳定再生。该传感器表现出高选择性、强的抗干扰能力和准确的定量能力

CRediT作者贡献声明

于伟华：撰写——原始草稿，正式分析，数据管理。何子龙：撰写——原始草稿，正式分析，数据管理。朱江海：撰写——原始草稿，正式分析，数据管理。郝新琪：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，方法学，正式分析，概念化。陈永欢：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，可视化，方法学，资金获取，正式分析，数据管理。李凤宇：撰写——

未引用参考文献

Zhang和Winfree，2009。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在竞争性利益的财务利益/个人关系：李凤宇报告获得了国家自然科学基金、广东省重点研发项目和广东省速度能力研究重点实验室的财务支持。陈永欢报告获得了杰出创新人才培养项目的财务支持

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（22474049）、广东省重点研发项目（2023A1515011031）、广东省速度能力研究重点实验室（2023B1212010009）以及济南大学的杰出创新人才培养项目（2025CXY320）的支持。此外，我们感谢eceshi（www.eceshi.com提供的XPS测试。