《PLOS Pathogens》：Anthrax-causing bacteria form biofilms on a soil-inspired porous glass bead model
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炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）及其新兴病原体B. cereus biovar anthracis (Bcbva)是引发致死性炭疽病的元凶，其在环境中以芽孢形式长期存活的特性，对公共卫生和生物安全构成持续威胁。尽管传统观点认为其增殖严格依赖于宿主，但本综述提出并验证了这两种病原体能够在宿主外通过形成生物被膜（Biofilm）进行增殖和生存的新假说。研究通过创新的三维仿土壤多孔玻璃珠（Porous Glass Beads, PGB）模型，结合共聚焦激光扫描显微镜、扫描电镜和定量细胞计数等多种技术，系统揭示了B. anthracis和Bcbva在类土壤条件下的生物被膜形成能力、动态结构特征（如空间分布、胞外基质分泌）和产孢规律。研究结果不仅证实了二者在环境中增殖的生态潜力，挑战了其“严格宿主依赖性”的经典认知，而且通过发现两者在生物被膜结构和密度上的差异（例如Bcbva更倾向于渗入PGB内部孔隙并更早形成芽孢），为Bcbva可能偏好土壤以外的环境生态位（如植物表面、小型水体）提供了线索。这深化了我们对炭疽病在自然环境中，特别是热带雨林与干旱草原等不同生态系统中，传播与持续机制的理解，对完善疾病预测模型、制定精准防控策略以及应对潜在的生物武器威胁具有重要的科学意义。
炭疽是一种由革兰氏阳性、可形成芽孢的炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）引起的致命性人畜共患病。尽管人类感染病例相对较少，但它对牲畜和野生食草动物，尤其是在干旱和半干旱草原生态系统中，构成持久威胁。此外，由于其曾被用作生物武器的历史，该病原体在生物防御和安全领域也受到持续关注。一个与其密切相关的病原体——蜡样芽孢杆菌炭疽变种（Bacillus cereus biovar anthracis, Bcbva），是撒哈拉以南非洲热带雨林的地方性病原体，可引发类炭疽疾病，对羚羊、猴子甚至大象等易感野生动物种群构成显著威胁。这两种病原体的致病性由两个几乎相同的大型毒力质粒（pXO1/pBCXO1 和 pXO2/pBCXO2）所携带，但它们的染色体背景存在显著差异，这可能导致它们占据不同的生态位，并影响其感染途径和环境持久性。
当前的主流观点认为，B. anthracis 和 Bcbva 几乎完全在宿主体内增殖，在环境中仅以休眠芽孢的形式存在，直到引发新的感染。B. anthracis 通常与干旱环境中的土壤传播相关，而 Bcbva 在植被茂密的热带雨林生态系统中的传播，则可能涉及食腐苍蝇。然而，这两种传播方式都存在显著的稀释效应，使得在自然条件下维持持续传播链条的可能性看似很低。一个替代假说是，这些病原体可以通过形成生物被膜在宿主外生存和增殖。生物被膜是附着于表面的、结构化的细菌群落，常嵌入自身产生的胞外聚合物基质中，能为细菌提供对抗干燥、抗菌剂等多种环境压力的保护。尽管生物被膜形成在 B. cereus 群的其他成员（如苏云金芽孢杆菌 B. thuringiensis）中已被广泛研究，但对于高致病性的 B. anthracis 和 Bcbva 的相关研究却非常有限，尤其是关于 Bcbva 的数据完全缺乏。
为了填补这一知识空白，本研究采用了一种经改良的多孔玻璃珠模型来探究这两种病原体的生物被膜形成能力。该模型选用的多孔玻璃珠具有高度可重复性，能产生大量生物被膜，且易于操作。更重要的是，通过傅里叶变换拉曼光谱分析证实，多孔玻璃珠的化学成分与撒哈拉沙漠沙粒（主要成分为 SiO2）高度相似，主要区别在于原子排列（结晶性 vs 非晶态）。研究表明，这种化学组成的相似性使得多孔玻璃珠成为模拟 B. anthracis 典型栖息地——土壤环境的理想模型。研究共使用了10株不同的菌株，包括5株 B. anthracis 和5株 Bcbva，涵盖了减毒株和野生型强毒株，其中8株强毒株在生物安全三级实验室中操作。
生物被膜模型与观察
细菌在接种于多孔玻璃珠上后，在30°C、高湿度条件下培养长达7天。研究人员在多个时间点（0小时、24小时、72小时、168小时）通过共聚焦激光扫描显微镜、扫描电子显微镜以及菌落形成单位计数和定量PCR来评估生物被膜的发展。
共聚焦激光扫描显微镜观察结果
共聚焦显微镜分析显示，所有测试菌株在接种24小时后均能在多孔玻璃珠上形成生物被膜。显著的细菌聚集体主要出现在玻璃珠的外缘区域，而在中心区域或孔隙内部仅观察到少量或没有细菌细胞。到72小时和168小时时，差异变得明显：B. anthracis 菌株的聚集体仍主要位于玻璃珠外缘，而 Bcbva 菌株则主要定位在玻璃珠的孔隙内部。一个例外是减毒株 Bcbva CAR-H，它在后期时间点似乎仍保留在玻璃珠外表面。由于 Bcbva 细胞大多位于孔隙内部，其在共聚焦图像光学切片中显示的整体生物被膜信号在72和168小时时显得比 B. anthracis 弱。
生物被膜形成的定量分析
通过菌落形成单位计数和定量PCR对附着在多孔玻璃珠上的细胞进行定量，结果与显微镜观察相互印证。所有菌株在培养的最初24小时内细胞数量均显著增加。在此初始生长阶段之后，菌落形成单位计数在168小时的观察期内保持相对稳定。定量PCR检测的基因组当量值也显示出类似的趋势，且所有时间点的基因组当量值均 consistently 高于其相应的菌落形成单位值，对于 B. anthracis 菌株最高可达十倍，但 Bcbva 菌株的这种差异较小。值得注意的是，B. anthracis 菌株 VAR28A88 的菌落形成单位计数异常低，但其基因组当量值却与其他菌株相当，表明其细菌可能处于“可存活但不可培养”状态。
定量比较显示，24小时后，两个物种的生长情况相近。但到72小时，B. anthracis 的细胞计数略有增加，而 Bcbva 的计数下降，导致两者出现统计学上的显著差异。到168小时，两者在细胞计数上的差异依然存在。
产孢差异
产孢计数显示了两物种之间的明显差异。计算产孢率（芽孢数占总菌落形成单位数的百分比）后发现，B. anthracis（不包括 VAR28A88）在24小时后的产孢率显著较低，仅为13.0% ± 12.0%，并且在168小时内整体产孢水平低于 Bcbva。相比之下，Bcbva 菌株 CA、RCA 和 DRC 在24小时时产孢率就已达到58.0% ± 13.0%，此后仅观察到微小的增加。这些差异具有高度统计学显著性。例外情况包括减毒 Bcbva 菌株 CAR-H（其产孢率与 B. anthracis 相似）和 Bcbva 菌株 CI（其在24小时时产孢率极低，但在72小时后显著增加）。
扫描电子显微镜观察结果
扫描电镜进一步揭示了生物被膜结构和产孢动态的细节。接种24小时后，B. anthracis 和 Bcbva 菌株之间没有观察到显著的形态差异，所有样品都显示出 B. anthracis 特有的紧密排列的细菌链，胞外基质产生极少，且未见可见芽孢。到72小时，菌株特异性差异变得明显。B. anthracis 19/39 和 Vollum 开始出现早期产孢迹象，而 B. anthracis Dobichau 和 VAR28A88 仍缺乏可见芽孢。相比之下，Bcbva 菌株在此时间点显示出更明显的产孢。扫描电镜图像还证实了生物被膜在多孔玻璃珠上的斑块状分布，与共聚焦观察一致。Bcbva 菌株在玻璃珠内部区域形成更致密的生物被膜结构，但整体生物被膜密度似乎低于 B. anthracis 和较早的时间点。在 Bcbva 菌株中，胞外基质的产生也更突出。到168小时，B. anthracis 和 Bcbva 菌株都表现出广泛的产孢和丰富的胞外基质产生，物种间没有实质性差异。再次例外的菌株是 VAR28A88，它没有显示任何产孢或基质产生，其生物被膜形态与24和72小时时相似。
讨论与意义
本研究首次系统地证实了 B. anthracis 和 Bcbva 在类土壤基质上形成生物被膜的能力。这一发现挑战了这两种病原体“严格宿主依赖”增殖和“仅以芽孢休眠”生存的传统观点，支持了其在宿主外具有复制和生活方式的假说。这对于解释炭疽病在已知病例数年后再爆发的现象具有重要意义，因为仅靠环境中芽孢的稀释和衰减难以解释这种长期的持续存在。
研究观察到两物种在生物被膜形成和产孢动态上存在差异。B. anthracis 在模拟土壤的多孔玻璃珠模型上表现更强，这与它典型的土壤储存库生态位相符。而 Bcbva 则表现出较弱的生物被膜形成、更早且更广泛的产孢，以及细胞计数在后期略有下降的趋势。这些差异暗示，对于 Bcbva 而言，土壤可能并非其最优的生存基质。考虑到 Bcbva 主要分布于热带雨林，且已有研究表明食腐苍蝇可在该环境中传播病原体并污染树叶、果实等地面以上基质，Bcbva 可能更适应土壤以外的生态位，如植物表面或小型水体。这扩展了对其环境持久性和感染途径的理解。
此外，B. anthracis B-分支菌株 VAR28A88 的独特表型（强大的生物被膜形成、极低的可培养性、缺乏产孢但代谢活跃）提示了其可能存在“可存活但不可培养”状态，这为理解细菌在逆境中的生存策略提供了新的视角。
总之，本研究通过创新的实验模型和多种技术手段，揭示了炭疽病原体在环境中形成生物被膜这一此前被忽视的生存策略。这不仅深化了我们对炭疽病生态学的认识，也为改进疾病传播预测模型、开发基于干扰生物被膜的新型防控措施（尤其在考虑生物防御的背景下）提供了重要的科学依据。未来的研究需要进一步探索 Bcbva 在植物表面等替代基质上的生物被膜形成能力，以更全面地揭示其传播循环。
