使用响应面方法、建模和优化从薄荷中提取酚类和抗氧化剂的超临界混合二氧化碳-氢气提取

《Industrial Crops and Products》：Supercritical hybrid carbon dioxide-hydrogen extraction for phenolics and antioxidants from mint using response surface methodology, modelling, and optimization

　　

本研究旨在通过一种新颖的超临界混合二氧化碳-氢气（Sp-CO₂-H₂）提取方法，结合数学建模、统计方法和多种优化技术，从薄荷中回收植物化学物质。在优化过程中，时间、压力和温度为自变量，而抗氧化活性（DPPH、ABTS）、总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）和酚类化合物为因变量（响应值）。在最佳Sp-CO₂-H₂条件（压力80?bar、时间5?min、温度60?°C）下，获得了TPC（52.59?mg GAE/100?mL）、TFC（41.93?mg RE/100?mL）、t-阿魏酸（2.05?mg/L）、迷迭香酸（6.10?mg/L）、抗氧化活性（ABTS为39.99?%，DPPH为33.20?%）、没食子酸（19.27?mg/L）、儿茶素（19.27?mg/L）和通过HPLC测定的TPC（45.01?mg/L）。这些发现进一步通过全面的多变量分析（PCA（主成分分析）、层次聚类和热图）得到证实，显示了预测数据与实验数据之间的高度相关性，为提取参数与所得植物化学图谱之间的相互作用提供了更深入的理解，确凿地验证了优化的成功。实验发现与RSM（响应面方法）预测结果非常相似。多变量分析揭示了总酚、总黄酮与抗氧化活性之间的强正相关性（r?>?0.9），并清楚地区分了两类主要生物活性物质：一类以一般酚类-抗氧化剂关联为主（TPC、TFC、DPPH、ABTS），另一类包括羟基肉桂酸衍生物（t-阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸）。结果揭示了薄荷生物活性物质（酚类、黄酮类和抗氧化剂）的自然分组以及提取条件对薄荷生物活性图谱的影响。这些结果表明，Sp-CO₂-H₂提取方法与响应面方法、数学建模和优化技术相结合，可有效用于从薄荷中提取植物化学物质。

**论文解读**

**研究背景与问题**
薄荷（*Mentha arvensis* L.）属于唇形科，广泛分布于温带地区，富含酚类、黄酮类等植物化学物质，具有抗炎、抗氧化和抗菌等生物活性。传统提取方法如水蒸馏、渗滤、索氏提取等耗时长、能耗高，且需要使用有机溶剂，存在毒性及环境问题。新兴绿色提取技术如超声波、微波、加速溶剂和超临界二氧化碳（Sp-CO₂）提取则更为环保高效。Sp-CO₂虽为非极性溶剂，但可通过添加极性改性剂（如水、乙醇）来提取极性化合物。分子氢（H₂）因其选择性清除细胞毒性自由基（尤其是羟基自由基和过氧亚硝酸盐）的能力而受到关注，且作为食品添加剂（E 949）安全。研究人员此前发现，富氢水（HRW）作为改性剂可增强Sp-CO₂对植物材料中植物化学物质的回收，因此假设将H₂直接与CO₂混合（而非仅作为改性剂）可能具有类似或更优的保护效果，尤其能防止氧化敏感化合物的降解。为此，本研究首次评估了一种将H₂作为还原剂纳入超临界CO₂提取的新型方法（Sp-CO₂-H₂），并利用响应面方法（RSM）结合数学建模与优化（MMO）技术，确定从薄荷中提取酚类、黄酮类和抗氧化剂的最佳操作参数。

**研究内容与结论**
研究人员开展了Sp-CO₂-H₂提取薄荷植物化学物质的优化研究。自变量为压力（60–80?bar）、时间（5–9?min）和温度（30–60?°C），因变量包括总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、抗氧化活性（DPPH和ABTS自由基清除活性）以及多种酚类化合物（如没食子酸、儿茶素、迷迭香酸等）。通过中央复合设计（CCD）和RSM进行实验设计与数据分析，采用方差分析（ANOVA）评估模型显著性，并利用主成分分析（PCA）、层次聚类分析（HCA）和皮尔逊相关热图进行多变量分析。研究得出最佳条件为压力80?bar、时间5?min、温度60?°C，在此条件下获得最高TPC（52.59?mg GAE/100?mL）、TFC（41.93?mg RE/100?mL）、ABTS抗氧化活性（39.99?%）及多种酚酸含量。多变量分析显示，预测值与实验值高度吻合（预测条件与实验条件的皮尔逊相关系数r=1.0），并揭示了两类主要生物活性簇：一类以TPC、TFC、DPPH、ABTS为主的一般酚类-抗氧化剂簇，另一类包括t-阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸等羟基肉桂酸衍生物簇。研究还发现温度是最具影响力的自变量。该论文发表在《Industrial Crops and Products》。

**关键技术与方法**
研究人员采用了以下主要关键技术：（1）超临界混合二氧化碳-氢气（Sp-CO₂-H₂）提取，使用CO₂:H₂:N₂=50:4:46（vol%）的混合气体作为溶剂，蒸馏水作为改性剂；（2）响应面方法（RSM）结合中央复合设计（CCD）进行实验设计与数学建模，通过方差分析（ANOVA）筛选显著模型（线性、2FI、二次、三次）；（3）多变量分析，包括主成分分析（PCA）、层次聚类分析（HCA）和皮尔逊相关热图，用于揭示变量间关系及验证优化。样品来源：薄荷（*Mentha arvensis* L.）于2024年10月采集自哈萨克斯坦阿拜地区乌尔贾尔区纳乌阿雷村，经当地供应商Zerde-Phito提供。

**研究结果**
**3.1 Sp-CO₂-H₂对薄荷提取物性质的影响：数学建模与优化（MMO）**
通过RSM和MMO对提取参数进行优化。在16组实验运行中，最佳条件（80?bar、5?min、60?°C）获得最高TPC（52.59?mg GAE/100?mL）、TFC（41.93?mg RE/100?mL）、ABTS抗氧化活性（39.99?%）及t-阿魏酸（2.05?mg/L）、迷迭香酸（6.10?mg/L）等酚酸。温度对氯原酸和t-阿魏酸影响显著（P?
**3.2 薄荷叶生物活性图谱的多重方差分析**
通过PCA、HCA和皮尔逊相关热图综合分析生物活性化合物之间的关系及提取条件的影响。PCA前两个主成分（PC1: 43.38%，PC2: 25.87%）解释了总方差的69.25%。PCA双标图显示，TPC、TFC、AA-DPPH、AA-ABTS形成紧密簇，位于PC1正侧，表明强正相关，且这些酚类黄酮类物质是抗氧化活性的主要贡献者。HCA树状图同样将TPC、TFC、AA-ABTS和AA-DPPH聚在一起。皮尔逊相关显示TPC与TFC（r=0.951）、TPC与AA-ABTS（r=0.965）、AA-ABTS与AA-DPPH（r=0.929）高度相关。另一类包括芦丁、氯原酸、p-香豆酸、咖啡酸等羟基肉桂酸衍生物，位于PC1负侧，形成独立簇。优化条件“Exp-80-5-60”与预测条件“Prd-80-5-60”在PCA中紧密相邻，且在HCA中聚集距离最小，皮尔逊相关系数为1.0，验证了优化模型的准确性和可靠性。热图也显示这两个条件对关键生物活性物质呈现高值（红色）。其他条件如“70-9-45”和“80-7-45”也表现出高值，而“60-9-60”和“70-7-60”性能较低。

**讨论与结论**
研究证实，Sp-CO₂-H₂提取方法结合RSM和MMO可有效从薄荷中回收酚类、黄酮类和抗氧化剂。最佳条件（低压、短时、较高温度）表明该技术可作为植物化学物质提取的绿色替代方案。多变量分析揭示了两类生物活性簇及其与提取参数的关系，为定向提取提供了依据。预测与实验的高度一致性验证了优化模型的鲁棒性。未来需进一步比较CO₂与H₂混合使用的效果，并关注H₂的腐蚀效应（可通过选用合适钢材、石墨涂层、避免氯离子等措施缓解）。研究结论：本研究评估了将氢气作为还原剂纳入超临界二氧化碳提取的新方法（Sp-CO₂-H₂），结合统计工具、数学建模和优化，确定了从薄荷叶中提取酚类、黄酮类和抗氧化剂的最佳参数。最佳条件为短时间（5?min）、高压（80?bar）和较低温度（60?°C）。该技术有望成为植物化学物质回收的替代方案。研究强调利用优化技术的重要性，氢气的引入以及超临界提取中的建模和统计工具为环保工艺策略和可持续性提供了优势。