《Antioxidants》：A Nasal Taxifolin Hydrogel Targets the TLR4/NF-κB/HIF-1α Axis to Suppress Ferroptosis in Alzheimer’s Disease
Miao Zhang,
Liangliang Zhu,
Yusu Wang,
Weijia Chen and
Zhongmei He
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本研究聚焦阿尔茨海默病（AD）治疗新靶点，首次系统揭示经鼻给药的负载花旗松素（Taxifolin）的温敏水凝胶（TF-Gel），通过精确调控TLR4/NF-κB/HIF-1α信号轴，有效抑制神经元铁死亡（Ferroptosis），并改善线粒体功能、减轻神经炎症与氧化应激，为AD的机制研究与治疗提供了创新视角与实验依据。
1. 引言：阿尔茨海默病（AD）是一种慢性神经退行性疾病，其病理机制复杂，涉及β淀粉样蛋白（Aβ）沉积和tau蛋白过度磷酸化等经典特征，但基于这些机制的治疗策略临床转化面临挑战。近年研究发现，铁死亡（Ferroptosis）和线粒体功能障碍这两种相互关联的细胞稳态失衡模式，是导致AD进展性神经元丢失的核心机制。花旗松素（TF）是一种具有优秀抗氧化、抗炎活性的天然分子，但传统给药方式效率受限。本研究提出将花旗松素与温敏水凝胶结合，构建鼻内给药系统（TF-Gel），旨在绕过血脑屏障实现高效脑靶向递送，并通过网络药理学与分子对接等系统方法，深入探究其通过调节铁死亡改善AD的机制。
2. 材料与方法：研究首先制备了花旗松素温敏水凝胶（TF-Gel）。通过整合网络药理学和分子对接分析，筛选出花旗松素与AD的交集靶点，并构建蛋白互作网络（PPI），预测核心靶点与关键通路。利用冈田酸（OA）诱导的AD小鼠模型，设置对照组、模型组、TF-Gel经鼻给药高低剂量组、口服阳性药组（H-IG）及TF-Gel联合铁死亡诱导剂Erastin干预组。通过Morris水迷宫评估行为认知功能，检测血清与海马组织生化指标（如ROS、SOD、IL-1β、TNF-α、ATP、GSH-Px、MDA等），进行海马组织H&E染色、尼氏染色、免疫荧光染色，并通过透射电镜（TEM）观察线粒体超微结构与铁死亡特征形态，利用JC-1探针检测线粒体膜电位（MMP），最后采用Western blot（WB）分析TLR4/NF-κB/HIF-1α信号通路、铁死亡调控蛋白（Fpn1、TfR1、DMT1、GPX4、DHODH）、突触与凋亡相关蛋白（tau、p-tau、SYP、PSD95、AIF、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3）的表达水平。
3. 结果：
3.1. 网络药理学与分子对接靶点分析：分析确定了花旗松素与AD的87个交集基因，PPI网络筛选出TLR4、HIF1A、PTGS2、NFKB1、MAPK1五个核心靶点。GO与KEGG富集分析揭示了靶点与AD相关通路的关联。分子对接显示花旗松素与这些核心靶点具有高亲和力，其中与TLR4、NFKB1、HIF1A的结合尤为稳定。
3.2. TF-Gel改善AD小鼠行为认知障碍：Morris水迷宫实验显示，经鼻给予高剂量TF-Gel（H-IN）可显著缩短AD模型小鼠的逃避潜伏期，增加其进入目标象限的次数和停留时间，其改善效果优于口服给药组，而联用铁死亡诱导剂Erastin则完全消除了TF-Gel的疗效。
3.3. 生化参数评估：与对照组相比，AD模型小鼠血清ROS、IL-1β、IL-6、TNF-α水平及海马MDA、Glu、LDH水平显著升高，而SOD、GSH-Px、ATP水平及线粒体复合物I活性显著降低。TF-Gel治疗，特别是H-IN组，能显著逆转这些异常指标。Erastin联合用药抵消了TF-Gel的改善作用。
3.4. 组织病理学分析：H&E和尼氏染色显示，AD模型小鼠海马神经元排列紊乱、数量减少，尼氏体活性降低。TF-Gel治疗，尤其是H-IN组，能显著改善神经元形态与结构，恢复尼氏体活性，而Erastin则逆转了此保护作用。
3.5. 免疫荧光染色分析：ROS免疫荧光显示，AD小鼠海马CA1、CA3、DG区神经元ROS荧光强度显著增强，表明存在广泛氧化损伤。TF-Gel治疗显著降低了ROS信号，H-IN组效果最强，Erastin则减弱了此效果。
3.6. TEM微结构检测：TEM观察发现，AD模型小鼠海马神经元线粒体形态异常，嵴结构紊乱甚至消失，并出现铁死亡特征性形态，如外膜破裂、膜密度异常增高等。TF-Gel治疗有效改善了线粒体形态与嵴结构，减轻了铁死亡特征。同样，Erastin削弱了TF-Gel的保护效果。
3.7. JC-1探针检测线粒体膜电位：流式细胞术与荧光显微镜成像分析均显示，AD模型小鼠线粒体膜电位严重去极化（红/绿荧光比降低）。TF-Gel治疗，特别是H-IN组，能显著恢复线粒体膜电位。
3.8. Western blot分析：WB结果显示：
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在AD模型小鼠中，突触与凋亡通路相关蛋白tau、p-tau、AIF、Bax、cleaved caspase-3表达上调，而SYP、PSD95、Bcl-2表达下调。TF-Gel治疗逆转了这些异常表达。
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铁死亡调控蛋白方面，AD模型中Fpn1、GPX4、DHODH表达下调，而TfR1、DMT1表达上调。TF-Gel治疗纠正了这些蛋白的异常表达。
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TLR4/NF-κB/HIF-1α信号通路在AD模型中被显著激活（TLR4、NF-κB、HIF-1α及下游iNOS表达上调，VEGF、Glut1表达下调）。TF-Gel治疗能有效抑制该通路的异常激活。同样，Erastin的联用抵消了TF-Gel对该通路及铁死亡相关蛋白的调控作用。
4. 讨论：本研究从行为、组织、细胞、分子多层面系统证实，经鼻给药的TF-Gel能够有效改善AD模型小鼠的认知功能障碍。其核心机制在于精确靶向并抑制TLR4/NF-κB/HIF-1α信号轴，从而打破神经炎症与氧化应激的恶性循环。该通路的抑制，一方面改善了细胞能量代谢（表现为ATP恢复、LDH降低），缓解了“假性缺氧”状态；另一方面，通过上游调控，协同修复了线粒体功能（表现为膜电位恢复、超微结构改善、复合物I活性增强），并重塑了细胞内铁稳态（纠正Fpn1、TfR1、DMT1表达）和抗氧化防御系统（提升GPX4、DHODH、GSH-Px活性）。线粒体功能的恢复为突触可塑性（SYP、PSD95上调）和神经营养（BDNF上调）提供了能量基础，并抑制了线粒体途径的细胞凋亡。最终，这些多靶点的协同作用，有效抑制了由铁依赖脂质过氧化驱动的神经元铁死亡。特别值得注意的是，铁死亡诱导剂Erastin完全逆转了TF-Gel的所有保护效应，直接证明了抑制铁死亡是其发挥神经保护作用的核心环节。与传统口服给药相比，温敏水凝胶鼻内递送系统显著提高了花旗松素的脑靶向效率和治疗效果。
5. 结论：本研究表明，负载花旗松素的温敏水凝胶（TF-Gel）通过鼻内给药，能够高效靶向大脑，并通过调控TLR4/NF-κB/HIF-1α信号轴，多层面地抑制神经元铁死亡。其作用涵盖减轻神经炎症与氧化应激、修复线粒体功能障碍、改善突触损伤与细胞凋亡。这为以铁死亡和线粒体功能为交叉靶点的AD协同治疗策略提供了新的实验依据和理论框架。
