刺梨汁通过抑制p53通路缓解氟诱导骨关节炎的机制探究：多组学整合揭示其活性成分与靶点互作网络

《Antioxidants》：Mechanistic Insights into Active Components of Rosa Roxburghii Juice Against Fluoride-Induced Osteoarthritis Youqi Du, Youwen Du, Shaobo Liu, Jun Li, Lianqing Tian, Longyu Yao, Jiajia Liao, Lingyun Fu, Yan Chen and Xiangchun Shen + 1 author

本综述通过整合生物信息学、网络药理学、分子对接与动力学模拟、有限蛋白酶解-质谱（LiP-MS）及体外实验，系统阐明了刺梨汁（RRJ）对氟诱导骨关节炎（F-OA）的保护机制。研究鉴定出TP53（p53）信号通路为关键调控枢纽，筛选槲皮素、表儿茶素、大黄素、鞣花酸为RRJ核心活性成分，证实其可通过直接结合TP53蛋白、抑制p53 mRNA表达并恢复蛋白酶体介导的p53降解，从而减轻氟化钠（NaF）诱导的细胞损伤、炎症与氧化应激，为RRJ作为防治氟骨症及F-OA的功能性食品提供了系统的药理学证据。

　　

研究背景与目的

氟诱导骨关节炎（F-OA）是地方性氟中毒的一种致残性表现，目前缺乏有效的预防或治疗策略。刺梨汁（Rosa roxburghii juice, RRJ）作为一种传统的药食同源产品，已被报道对氟骨症具有保护作用，但其活性成分及分子机制尚未完全阐明。本研究旨在采用整合策略，系统揭示RRJ对抗F-OA的保护机制、鉴定其关键活性成分并阐明其作用靶点与通路。

材料与方法

本研究采用了一套综合性的研究方法体系。首先，从基因表达综合（GEO）数据库获取骨关节炎相关数据集，通过生物信息学分析鉴定差异表达基因（DEGs），并与来自比较毒物基因组学数据库（CTD）、STITCH、ChEMBL、PubChem的氟化钠相关基因取交集，最终确定了44个核心F-OA相关基因。通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络，并利用Cytoscape进行拓扑分析识别枢纽基因。通过Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析探索这些基因的生物学功能与通路。

研究通过文献检索和数据库（如PubChem、SwissTargetPrediction、TCMSP）预测了RRJ的活性成分及其潜在靶点，并与核心F-OA基因集取交集，构建“化合物-靶点-疾病”桑基图。通过分子对接（使用AutoDock Vina）评估活性成分与核心靶点蛋白（如TP53、AKT1、BAX等）的结合亲和力，并结合分子动力学（MD）模拟（使用GROMACS）和MM/PBSA结合自由能计算验证相互作用的稳定性。

体外实验采用大鼠滑膜成纤维细胞（RSFs）模型。通过MTT法检测细胞活力，建立氟化钠（NaF）损伤模型，并评估槲皮素、表儿茶素、大黄素、鞣花酸四种RRJ活性成分的保护作用。利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和p53的mRNA表达。通过流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）水平和细胞周期分布。使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞上清液中炎症因子蛋白水平。通过蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光分析p53、磷酸化p53（P-P53）、P21等蛋白的表达与定位。采用有限蛋白酶解-质谱（LiP-MS）技术分析药物处理后全蛋白组的构象重塑情况。通过放线菌酮（CHX）追逐实验和CHX+蛋白酶体抑制剂MG132实验评估p53蛋白的稳定性与降解途径。

结果

1. 1.
   核心基因与通路鉴定：整合生物信息学分析确定了44个核心F-OA相关基因。PPI网络和富集分析表明，TP53（p53）及其相关的p53信号通路是关键的调控枢纽。KEGG通路富集还涉及氧化应激、TNF信号通路等。GO分析显示这些基因主要参与对氧化应激的反应、线粒体细胞色素c释放的调节等生物过程。
2. 2.
   RRJ活性成分筛选与网络药理学预测：网络药理学分析从RRJ中筛选出7种与核心靶点相互关联的活性成分，其中槲皮素（Quercetin）、表儿茶素（Epicatechin）、大黄素（Emodin）和鞣花酸（Ellagic acid）被预测为与核心靶点关联度最高的关键生物活性成分。桑基图直观展示了这些成分与TP53、PTGS1、MMP12、IL1A等9个核心靶点及F-OA疾病的关联。
3. 3.
   分子对接与动力学模拟验证：分子对接显示，四种活性成分与核心靶点蛋白（尤其是TP53）的结合能均低于-5.0 kcal·mol^-1，表明具有强结合亲和力。进一步的80 ns分子动力学模拟表明，这些成分与TP53形成的复合物结构整体稳定。MM/PBSA计算得出的结合自由能均为负值，证实结合是热力学自发过程，其中大黄素与TP53的结合自由能最低（-20.44 kcal·mol^-1）。
4. 4.
   体外细胞实验验证保护作用：细胞实验表明，600 μM NaF可显著降低RSFs细胞活力，诱导G₁期细胞周期阻滞，并上调炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10）的mRNA和蛋白表达，同时大幅增加细胞内ROS水平。而槲皮素、表儿茶素、大黄素、鞣花酸四种成分的预处理，能有效逆转NaF引起的这些细胞损伤，恢复细胞活力，缓解细胞周期阻滞，并显著抑制炎症反应和氧化应激。
5. 5.
   LiP-MS揭示蛋白构象重塑：LiP-MS分析发现，经四种活性成分联合处理后，细胞中发生了广泛的蛋白质构象重塑，共有2396个蛋白的肽段丰度上调，1492个下调。KEGG分析显示差异蛋白富集于氧化磷酸化、内质网蛋白加工等通路。特别值得注意的是，TP53蛋白的多个肽段在药物处理后表现出显著的结构敏感性变化，提示这些活性成分可能直接影响了TP53的构象。
6. 6.
   作用机制聚焦p53通路：机制研究表明，NaF暴露会上调p53的mRNA转录，并抑制蛋白酶体介导的p53蛋白降解，导致p53蛋白异常累积和核内聚集。而槲皮素、表儿茶素、大黄素、鞣花酸能够通过双重调控发挥作用：一方面抑制p53的mRNA表达，另一方面恢复蛋白酶体对p53的正常降解功能，从而有效降低细胞内p53蛋白水平，减轻其异常活化带来的细胞损伤。
7. 7.
   RRJ中活性成分的定性与定量分析：高效液相色谱（HPLC）定量分析证实，RRJ中确实含有表儿茶素（41.11 mg/mL）和鞣花酸（0.63 mg/mL）。超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）定性分析共鉴定出130种化学成分，表儿茶素和鞣花酸被明确检出。槲皮素和大黄素未以游离形式直接检出，但检测到了槲皮素的衍生物（如槲皮素3,4'-二葡萄糖苷），提示它们可能以苷类形式存在，在体内代谢后释放出活性成分。

讨论与结论

本研究通过多组学整合策略，系统揭示了刺梨汁（RRJ）缓解氟诱导骨关节炎（F-OA）的分子机制。TP53（p53）信号通路被确定为F-OA发病机制中的核心调控枢纽。槲皮素、表儿茶素、大黄素、鞣花酸是RRJ中对抗F-OA的关键活性成分。它们通过直接与TP53等靶点蛋白高亲和力结合，抑制p53的转录表达，并恢复蛋白酶体依赖的p53降解途径，从而减轻氟离子诱导的氧化损伤、炎症反应和细胞周期紊乱。这些发现为RRJ作为一种多组分、多靶点的药食同源功能性食品，用于预防和管理氟骨症及相关骨关节炎提供了系统的药理学依据和深入的科学见解。