《International Journal of Molecular Sciences》：Ubiquitin System-Driven Proteostasis in DNA Damage Response
Renata Kusuma,
Audrey Regina Valerie,
Sisi Qin,
Kitty Ichiwa,
Kenneth Joshua,
Gayoung Seo and
Wootae Kim
1. 引言
蛋白质是执行细胞内多种生命过程的基本元件。细胞通过一个协调的网络来调控蛋白质的可用性与活性，这一过程被称为蛋白稳态（Proteostasis, PN）。蛋白稳态网络通过精确调控，确保蛋白质在特定情境下被稳定并保持活性，同时将受损或不再需要的蛋白质选择性清除。
泛素系统是执行蛋白稳态的核心。它通过泛素化和去泛素化两个动态过程，根据细胞状态决定蛋白质的命运。泛素化由泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）介导的三步酶促级联反应完成。而去泛素化酶（DUBs）则负责移除底物蛋白上的泛素修饰。两者的相互作用为蛋白质命运提供了可逆的精细调控，使细胞能响应需求和压力调整蛋白稳态。
细胞不断面临可导致DNA损伤的压力。为维持基因组完整性，它们演化出了协调的监视与修复系统，即DNA损伤应答（DDR）。DDR是一个高度动态的信号网络，其失调与癌症、神经退行性疾病和衰老等多种疾病密切相关。因此，细胞对DDR进行严格调控，确保其仅在DNA损伤时激活并在修复完成后及时关闭。
越来越多的证据表明，蛋白稳态与DDR信号传导紧密相连。蛋白稳态的破坏会阻碍DNA损伤修复能力，导致DNA病变累积和基因组不稳定。蛋白稳态提供了一个调控框架，可稳定DDR蛋白或通过蛋白质降解主动终止它们，从而决定DDR机器的功能寿命。特别是，泛素系统通过蛋白水解和非蛋白水解机制保护DDR通路，不断调节DDR蛋白的降解、空间募集和信号动态。
2. 泛素化维持DDR机器的蛋白稳态
泛素化是调控DDR因子稳定性、周转和可用性的重要翻译后机制。不同形式的泛素链可与DDR蛋白结合，介导非降解性的信号调节或通过蛋白酶体介导的蛋白水解性破坏。这种双重调控机制确保某些DDR组分在DNA损伤位点被空间保留和激活，而其他组分在不再需要时被有效清除，防止干扰DDR信号传导。
泛素包含七个赖氨酸（K）残基，促进了结构多样的单泛素化或多聚泛素化链的组装。不同的泛素链连接类型修饰底物，编码了不同的功能结果。蛋白水解性泛素化主要通过K48或K11连接的泛素链，靶向DDR蛋白进行26S蛋白酶体介导的降解，这对及时清除可能干扰检查点控制或DNA修复机制的DDR调节因子至关重要。相比之下，泛素系统的非降解性功能同样关键。K63连接的泛素链常在DNA损伤位点作为下游修复效应物的募集平台，并在蛋白质质量控制中发挥重要作用。
2.1. 泛素化对DDR机器的蛋白水解性调控
E3泛素连接酶RNF138是DDR内蛋白水解性泛素化的典型代表。被募集到DNA双链断裂（DSB）位点后，RNF138促进包括Ku70/Ku80复合物在内的DNA修复蛋白的泛素化。通过组装蛋白水解性泛素链，RNF138触发Ku蛋白从DNA末端的蛋白酶体依赖性移除，这是修复通路正常进展的关键步骤。这种调控性分解防止了Ku在损伤位点的持续滞留，否则会空间阻碍后续的修复过程。
另一个DDR中蛋白水解性泛素化的特征是E3泛素连接酶MDM2。在基础条件下，肿瘤抑制因子p53被MDM2泛素化，通过组成性的蛋白酶体降解维持较低的p53基础水平。在DNA损伤时，MDM2活性被抑制导致p53积累，从而激活细胞凋亡或细胞周期阻滞程序。
SCF E3泛素连接酶复合物也在介导DDR蛋白的蛋白水解性泛素化中发挥关键作用。在DDR背景下，SCF复合物促进关键检查点调节因子（如CDC25A和Claspin）在DNA损伤后或检查点恢复期间的降解。通过SCF介导的降解及时终止检查点信号传导，对于防止持续的细胞周期停滞和恢复正常细胞功能至关重要。
2.2. 泛素化对DDR机器的非蛋白水解性调控
除了降解，DSB修复的激活关键依赖于非蛋白水解性泛素化事件。RNF168是一种RING型E3泛素连接酶，通过催化K27和K63连接的泛素链与染色质相关组蛋白H2A和H2A.X结合，在响应DSBs时扩增和增强泛素依赖性DDR信号传导。这些表观遗传修饰作为分子支架，募集关键的DDR调节因子（如53BP1和BRCA1）到DNA损伤位点。
尽管RNF168在DSB修复期间以泛素化H2A型组蛋白而闻名，但H1型组蛋白在此过程中也通过E3连接酶RNF8和E2结合酶UBC13的协同作用被修饰。RNF8和UBC13介导H1组蛋白的K63连接泛素化，创建一个初始的结合平台，在诱导DSB后触发RNF168募集到DNA损伤位点。
类似地，E3泛素连接酶RAD18与E2酶RAD6一起，在停滞的复制叉处介导增殖细胞核抗原（PCNA）的单泛素化，以促进跨损伤合成（TLS），而不会在DNA损伤后诱导蛋白酶体降解。当复制叉停滞时，复制蛋白A（RPA）识别并覆盖暴露的单链DNA（ssDNA）以稳定复制叉并防止其崩溃。RAD18识别RPA包被的ssDNA结构，结合到RPA-ssDNA复合物，随后募集RAD6。RAD18/RAD6复合物然后将单个泛素转移到PCNA的K164位点。单泛素化的PCNA作为TLS聚合酶的结合位点，募集高保真的复制聚合酶以恢复DNA合成，并允许复制越过DNA损伤位点。TLS的激活对于防止复制叉长时间停滞和崩溃至关重要，从而抑制DSB形成和大规模染色体不稳定。
2.3. DDR中泛素化的失调及其与疾病进展的相关性
泛素化过程的失调日益被认为是导致DDR信号传导缺陷和疾病进展的关键驱动因素。泛素化通过蛋白水解和非蛋白水解机制调节DDR蛋白的稳定性、定位和活性，促进DNA损伤的精确检测、信号传导和修复。在DSB位点精确的泛素信号传导对于协调修复通路选择和维持基因组完整性至关重要。这一调控层的破坏会损害修复保真度并促进基因组不稳定，这是癌症的标志。
RNF168的失调，特别是通过过表达，会破坏泛素依赖性DDR信号传导的紧密平衡。过度的RNF168活性增加了H2A/H2AX泛素化，导致53BP1异常和持续积累，并损害BRCA1在DNA损伤位点的募集。这种不平衡使修复通路选择偏向易错的非同源末端连接（NHEJ），同时抑制同源重组（HR），导致基因组不稳定。
E3泛素连接酶NEDD4-1通过调节关键肿瘤抑制因子和信号通路的蛋白水解性调控，从而导致DDR中泛素化的失调。在病理条件下，NEDD4-1的激活促进了PTEN的K48连接泛素化和蛋白酶体降解，PTEN是PI3K/AKT通路的关键负调节因子。PTEN稳定性的丧失导致持续的PI3K/AKT信号传导，从而增强存活信号，抑制DNA损伤检查点，并允许细胞在不解决的基因组病变情况下进行分裂。这种蛋白水解失衡损害了DDR蛋白稳态，缩短了检查点控制的有效持续时间，并有利于增殖而非修复，进而促进包括肺癌在内的多种恶性肿瘤的肿瘤发展。
同样，RING型E3泛素连接酶TRC8（也称为RNF139）调节参与生长和压力信号传导的蛋白质的蛋白水解性周转。除了NEDD4-1介导的PTEN降解，TRC8还通过促进导致不受控增殖的底物的泛素依赖性降解而起到肿瘤抑制因子的作用。TRC8的丢失或失活破坏了这种蛋白水解性调控，导致促增殖信号通路的稳定性，从而损害DDR检查点的执行，允许细胞在DNA损伤后分裂，促进基因组不稳定和肿瘤生长。
HERC2是DDR信号传导中的一个关键E3泛素连接酶，其失调与多种恶性肿瘤有关。在DNA双链断裂后，HERC2被募集到γH2AX-MDC1平台，在那里它刺激RNF8寡聚化和RNF168依赖性组蛋白泛素化。这种活性对于DDR因子（包括53BP1和BRCA1）的正常积累至关重要。HERC2的体细胞突变和扩增见于子宫体子宫内膜癌、皮肤黑色素瘤、肺腺癌和肉瘤，导致DDR蛋白稳态受损和基因组不稳定性增加。此外，HERC2对MDM2-p53轴的反常调控使受损细胞能够逃避检查点控制，从而促进肿瘤发生和进展。
3. 去泛素化维持DDR机器的蛋白稳态
为维持DDR机器的蛋白稳态，泛素信号必须精确平衡。去泛素化代表了一个关键的调控过程，在整个DDR中微调泛素信号传导。去泛素化酶（DUBs）通过蛋白水解和非蛋白水解机制抵消DDR蛋白的泛素依赖性蛋白酶体修饰，在这一过程中发挥重要作用，防止不适当的蛋白酶体降解并确保正确的DDR信号传导。
3.1. 去泛素化对DDR机器的蛋白水解性调控
具有此功能的最具特征的去泛素化酶之一是USP7。USP7是一种泛素特异性蛋白酶，通过从其底物上移除K48连接的多聚泛素链来防止泛素依赖性蛋白酶体降解。其最知名的靶标之一是p53蛋白，p53在去泛素化后得以稳定和积累。p53的稳定对于其促进细胞周期阻滞和DNA修复的转录程序至关重要，在决定细胞命运中起关键作用。除了p53，USP7还通过类似地防止其降解来调节Claspin的稳定性。稳定的Claspin对于持续的检查点激活和有效的DNA修复至关重要。
另一个参与此调控过程的去泛素化酶是USP13，它控制TOPBP1的稳定性，TOPBP1是协调检查点激活（特别是在ATR–CHK1介导的复制应激响应中）所需的核心支架蛋白。鉴于TOPBP1在维持DNA损伤诱导的细胞周期检查点中的关键作用，其蛋白质稳定性对于有效的DDR信号传导至关重要。USP13从TOPBP1上移除降解性泛素链，防止其泛素依赖性蛋白酶体降解。通过稳定TOPBP1，USP13确保适当的检查点激活，保持DDR保真度，并保护基因组稳定性。
另一个例子是去泛素化酶USP11，它调节染色质组织和关键修复因子（包括53BP1）的稳定性。USP11抵消53BP1的泛素依赖性蛋白酶体降解，维持足够的53BP1水平以供其募集到DNA DSB。适当的USP11活性确保53BP1在损伤位点的受控积累，促进DNA末端保护，并限制过度的DNA末端切除。通过这种调控，USP11有助于适当的DNA修复通路选择，并在DDR期间支持基因组稳定性。
同样，在USP家族中，USP28是一种半胱氨酸蛋白酶去泛素化酶，与53BP1协调调节p53稳定性。在DNA损伤时，USP28被53BP1的串联BRCT结构域募集到损伤位点，在那里它直接去泛素化p53并防止其泛素依赖性蛋白酶体降解。p53的这种稳定保持了其蛋白质水平，确保p53依赖性转录激活靶标（如p21），维持G1检查点保真度，从而在压力响应（包括中心体丢失或电离辐射）期间支持基因组稳定性。
3.2. 去泛素化对DDR机器的非蛋白水解性调控
USP1是USP家族成员，以其在去泛素化单泛素化信号中的作用而闻名。在范可尼贫血（FA）DNA修复通路中，USP1与其辅因子UAF1一起，从染色质上的FANCI-FANCD2异二聚体上移除单泛素信号。这种去泛素化是修复完成后FANCI-FANCD2复合物从DNA上解离所必需的，从而使得复制机器能够正确重启。
BRCC36是BRCA1-A复合物的一个组分，在DNA DSB处起到K63连接去泛素化酶的作用。通过选择性地从受损染色质上移除泛素，BRCC36微调泛素信号以确保BRCA1-A复合物的稳定锚定。这促进了BRCA1-A复合物在损伤位点的受控保留，并限制过度的DNA末端切除，从而有助于维持基因组稳定性。
ATXN3是一种主要调节非降解性泛素信号传导的去泛素化酶。它编辑和修剪染色质上的K63连接泛素链，调节DDR复合物的组装和解组装。ATXN3与DDR支架蛋白（如MDC1）以及检查点调节因子（包括CHK1）相互作用，有助于损伤位点泛素信号的精确细化。通过这种非蛋白水解性的去泛素化活性，ATXN3协调DDR复合物的动态组织，促进及时的检查点和修复信号传导，并防止DDR过度或过长的激活。
3.3. DDR中去泛素化的失调及其与疾病进展的相关性
去泛素化的精确调控对于维持DDR因子的蛋白稳态至关重要。去泛素化酶的失调会破坏DDR信号动态，导致修复分辨率缺陷、检查点激活延长或异常凋亡。此类扰动有助于人类疾病的发展，包括癌症和代谢紊乱。
据报道，USP7在多种癌症中过表达，包括多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌，其活性升高促进了肿瘤细胞存活。从机制上讲，USP7通过去泛素化稳定E3泛素连接酶MDM2和MDMX，导致p53被抑制。这种活性损害了p53依赖性检查点控制，从而促进了基因组不稳定。
此外，USP7在宫颈癌中上调，其表达与患者不良预后相关。在DNA损伤时，USP7直接与MRN–MDC1复合物结合并去泛素化MDC1，促进其稳定和在DNA DSB位点的持续积累。MDC1的稳定促进了MRN–MDC1信号平台的组装和保留，导致DSB响应通路激活延长，增强了癌细胞的存活和增殖。
USP1与其辅因子UAF1形成活性去泛素化复合物，并可结合RAD51AP1以调节关键的DDR底物，包括PCNA和FANCI–FANCD2异二聚体。USP1活性的丧失直接损害FANCD2的去泛素化，导致其单泛素化延长。这些修饰维持了DDR信号传导，导致修复分辨率缺陷、复制应激敏感性增强、染色体异常和细胞功能障碍，包括骨髓衰竭和DNA交联剂超敏反应——这些都是FA表型的标志。
相比之下，USP1失调也在诱导持续性DNA损伤的慢性应激条件下被观察到。在这种情况下，持续的USP1活性会延长DDR信号传导。DDR通路的持续激活有利于凋亡反应而非成功的修复，促进β细胞凋亡。β细胞质量的损失因此减少了胰岛素产生，并导致糖尿病的发展。
去泛素化酶ATXN3的失调，特别是多聚谷氨酰胺扩展，会损害其DUB功能，并破坏适当调控DDR所需的信号传导，特别是在有丝分裂后神经元中。因此，泛素信号在损伤位点持续存在，导致修复分辨率缺陷和未修复的DNA损伤累积。在有丝分裂后神经元中，这种持续的DNA损伤会触发慢性的DDR激活和细胞功能障碍，最终导致脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）特征的进行性神经退行性变。USP28的失调，特别是通过癌症相关突变，破坏了有丝分裂监视所需的关键结构特征，包括与53BP1的C端相互作用、USP28二聚化、核定位和蛋白质稳定性。因此，突变的USP28未能抑制p53泛素化，导致p53稳定性降低和p53依赖性生长停滞激活受损，这使得细胞即使在有丝分裂错误的情况下也能继续增殖。这种有缺陷的有丝分裂监视允许染色体不稳定性和有丝分裂缺陷的积累，促进肿瘤进展而非触发基因组受损细胞的清除。
4. 临床意义
靶向泛素信号传导代表了对广泛疾病有前景的治疗策略，因为泛素化和去泛素化在调节DDR信号传导中起着重要作用。在DDR中靶向泛素系统的治疗原理根本上基于合成致死原理。在药理学上，抑制特定的E3连接酶或DUB可以利用癌细胞预先存在的遗传脆弱性，例如HR缺陷。这种方法创造了一个治疗窗口，使得已经在一个修复通路中存在缺陷的癌细胞，在第二个泛素调控的补偿机制被破坏时，经历灾难性的基因组不稳定，而具有完整修复能力的正常细胞则得以幸免。
调节泛素连接酶和DUB会影响泛素依赖性DDR因子的募集和保留，改变修复通路选择，并扰乱检查点信号传导。因此，抑制选定的泛素连接酶或DUB可以使癌细胞对化疗和放疗等常规治疗敏感，同时通过肿瘤特异性的合成致死相互作用潜在地最小化对正常组织的毒性。
4.1. 靶向DDR泛素化的治疗药物
4.1.1. E1抑制剂
TAK-243（也称为MLN7243）是UBA1的选择性抑制剂，可阻断泛素化级联反应的启动。TAK-243抑制UBA1，消耗细胞泛素结合物并破坏泛素依赖性信号传导和DNA修复，导致细胞周期停滞和癌细胞死亡。它结合UBA1腺苷酸化位点形成稳定的UBA1-泛素加合物，阻断泛素激活和向E2酶的转移，并引发蛋白质毒性和内质网应激。临床前研究表明TAK-243在异种移植模型中表现出强大的抗肿瘤活性，并使癌细胞对基因毒性应激敏感，突显了E1酶抑制作为利用癌症中泛素介导的DDR依赖性的一种潜在策略。
4.1.2. E2抑制剂
NSC697923是E2泛素结合酶UBE2N（Ubc13）的抑制剂，其催化K63连接的泛素化。它共价靶向UBE2N的活性位点半胱氨酸，阻断RNF8/RNF168依赖性DSB信号传导所需的K63连接泛素链形成。这阻止了修复因子（如53BP1和BRCA1）的募集，削弱DSB修复并增加复制应激。临床前研究表明，NSC697923与CX-5461联合使用时，可增强HCT116结肠癌细胞对CX-5461治疗的敏感性。截至目前，NSC697923仍是一种临床前研究抑制剂。
4.1.3. E3抑制剂
在靶向泛素通路的药物中，E3泛素连接酶抑制剂是研究最为深入的，特别是靶向MDM2拮抗剂的药物。关键分子化合物包括Nutlin 3及其衍生物Idasanutlin，它们是MDM2（负责肿瘤抑制因子p53泛素化和蛋白酶体降解的E3泛素连接酶）的选择性小分子抑制剂。通过破坏MDM2–p53相互作用，Idasanutlin可防止p53泛素化和周转，导致p53稳定并激活驱动细胞周期阻滞和凋亡的下游转录程序。在临床上，针对复发或难治性急性髓系白血病患者的I/II期研究表明，Idasanutlin治疗后p53通路发生药效学激活，并显示出可测量的抗白血病活性。然而，临床获益在很大程度上仅限于保留野生型p53的肿瘤，且剂量限制性的胃肠道和血液学毒性使剂量优化复杂化。
4.2. 靶向DDR去泛素化的治疗药物
4.2.1. USP1抑制剂
SP-002已被报道为USP1的一种强效选择性抑制剂，具有作为单一疗法或与PARP1抑制剂奥拉帕利联合使用的潜力。SP-002抑制USP1会增加PCNA泛素化，从而损害DNA复制并诱导S/G2细胞周期阻滞，最终抑制肿瘤生长。值得注意的是，SP-002和PARP抑制剂的联合治疗在同源重组缺陷细胞系中协同诱导细胞死亡，导致复制应激诱导的凋亡增强。该药物也显示出较低的血液学毒性，突显了USP1抑制作为一种有前景的治疗策略，尽管临床数据仍然有限。
此外，匹莫齐特是一种FDA批准的药物，传统上用于治疗妥瑞氏症和精神分裂症。匹莫齐特已被确定为USP1的功能性抑制剂，并已在多项临床前研究中进行评估。最近的证据表明，匹莫齐特治疗抑制USP1活性，导致MAX/MYC泛素化增加、MYC靶基因表达减少以及淋巴瘤细胞生长抑制。此外，MYC驱动的癌症表现出升高的复制应激和对DDR通路的更高依赖性，支持了USP1抑制在利用这些恶性肿瘤中DDR相关脆弱性方面的治疗潜力。
4.2.2. USP10和USP13抑制剂
Spautin-1是USP10和USP13的强效选择性小分子抑制剂，已被广泛用作临床前工具化合物。Spautin-1抑制USP13可增强卵巢癌细胞系对PARP抑制剂的敏感性，表明USP13活性与HR修复通路之间存在功能相互作用。此外，据报道，Spautin-1单药治疗可减弱ATR–CHK1信号传导，导致复制应激相关的细胞死亡。临床前研究表明，Spautin-1可能对依赖HR修复通路的癌症有效。然而，尚未进行临床试验，治疗相关的毒性数据尚不可用。
4.2.3. 广谱USP抑制剂
VLX1570是首批进入临床评估的小分子去泛素化酶抑制剂之一，是b-AP15的临床类似物。VLX1570主要靶向USP14和UCHL5，破坏蛋白酶体相关的去泛素化，导致多聚泛素化蛋白质累积和蛋白质毒性应激，从而触发肿瘤细胞凋亡。虽然它在一项针对多发性骨髓瘤患者的I期临床试验中进行了评估，但该研究因严重的剂量限制性毒性而终止。
相比之下，YM155最初被鉴定为Survivin抑制剂，并已针对其在多种恶性肿瘤中的抗癌活性进行了广泛研究。临床前研究表明，YM155在多种癌症中抑制肿瘤生长，并已进入I期和II期临床试验。此外，越来越多的证据表明，YM155可以破坏ATR/ATM依赖性信号传导并抑制FA修复通路，导致DNA修复能力受损和对基因毒性应激的敏感性增加。虽然早期临床试验表明该药物通常耐受性良好，但患者的详细疗效和毒性特征尚未完全确定。
5. 挑战与展望
蛋白稳态是协调DDR信号传导的基本细胞过程。蛋白稳态的破坏会导致受损或错误折叠蛋白质的累积，最终导致基因组不稳定和多种疾病标志（包括肿瘤发生）的发展。因此，理解蛋白稳态如何与DDR调控相互作用对于确定有效的治疗靶点至关重要。
泛素化和去泛素化在动态和严格调控的平衡中运行，以确保准确的DDR信号传导。这种协调的泛素标记周转使得修复因子的募集和信号扩增具有精确的时空控制。这种平衡的破坏会损害DNA修复效率，改变检查点激活，并降低细胞在基因毒性应激后的存活率。正如本综述所强调的，泛素结合酶和去泛素化酶的药物靶向代表了一种有前景的治疗策略，可以选择性破坏DDR信号传导并增强DNA损伤疗法的疗效。
尽管越来越多的证据支持泛素介导的蛋白稳态参与DD
