综述：面团中麸质蛋白多尺度结构表征的关键方法学比较

《Biomolecules》：Key Methodologies in Characterizing the Multi-Scale Structures of Gluten Proteins in Dough: A Comparative Review Feifei Su, Yiyuan Zou, Zehua Zhang, Zhiling Tang, Haoran Luo, Fayin Ye and Guohua Zhao

　　

麸质蛋白是小麦粉中的关键成分，决定着面团的形成和面制品质量。在加水混合后，麸质蛋白经历复杂的结构转变，形成麸质网络，表现出跨越分子、聚集体和网络尺度的分层多尺度结构。由于麸质蛋白极其复杂，准确表征其多尺度结构仍具挑战性，需要多种技术的联合应用，目前这些技术仍相对有限，值得进一步探索。因此，本综述介绍了当前在不同结构尺度上应用的技术的原理、操作细节和结果呈现，包括分子尺度的电泳、高效液相色谱、蛋白质组学、傅里叶变换红外光谱和傅里叶变换拉曼光谱；聚集体尺度的尺寸排阻色谱、不对称流场流分级、动态光散射、多角度光散射、示差折光检测和紫外吸收；以及网络尺度的共聚焦激光扫描显微镜、扫描电子显微镜、共聚焦拉曼显微镜和双光子激发显微镜等。综述进一步比较了相似技术的优缺点，以促进其基于场景的选择性应用。最后，概述了用于麸质蛋白多尺度结构表征的技术开发与应用所面临的持续挑战和未来前景。

论文主体内容总结

1. 引言

小麦是世界主要粮食作物之一。面团形成被定义为主要由麸质蛋白在分子、聚集体和网络三个尺度上发生的动态过程。在此过程中，麸质蛋白通过各种分子间相互作用构建三维网络，并将水合的淀粉颗粒包裹其中。面团质量最终由麸质蛋白中上述多尺度结构的形成所决定。为了评估面团质量，有必要辨别面团形成不同阶段中这些多尺度结构的数量、结构特征和空间分布。本文旨在：系统考察面团中麸质蛋白多尺度结构的表征方法；辨别可用于同一测试指标的不同方法的优缺点，并阐明每种方法的适用场景；评估特定方法在不同条件下操作时的工作性能，促进其标准化；为不同类型面团或小麦面制品中的麸质网络建立综合方法学体系。

2. 分子尺度表征麸质蛋白的方法

2.1. 麸质组分的定量

通常，根据溶解度可将小麦中的麸质蛋白分为醇溶蛋白和谷蛋白。定量麸质组分通常分两步：分级分离和定量。分级分离常采用Osborne法和顺序提取法。两种方法都可将小麦粉或面团中的麸质蛋白分级为醇溶蛋白和谷蛋白。Osborne法更适合大规模制备麸质组分，而顺序提取法则特别适用于精确分析麸质亚组分。在分级步骤之后，通常采用凯氏定氮法、杜马斯燃烧法或比色法测定所得麸质组分的蛋白质含量。凯氏法和杜马斯法几乎适用于任何情况，而比色法仅适用于可溶性蛋白。

2.2. 麸质组分单体/亚基组成分析

2.2.1. 电泳

为了鉴定和半定量评估醇溶蛋白单体和谷蛋白亚基，常进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和二维凝胶电泳。SDS-PAGE在操作简易性、成本、通量和时间上更具优势，而2-DE则在分辨率和灵敏度上显著优于SDS-PAGE。SDS-PAGE适用于组分较少的级分，而2-DE则适用于考虑包含大量组分的复杂级分。

2.2.2. 高效液相色谱

为了分离和鉴定特定麸质级分中的蛋白质成分，有时会应用体积排阻高效液相色谱和反相高效液相色谱，尽管它们以不同模式工作。SE-HPLC根据分子量（更具体地说是流体力学体积）分离目标蛋白。RP-HPLC则基于疏水性的差异分离蛋白质。SE-HPLC可获得关于组分鉴定、分子量和丰度的信息，而RP-HPLC仅能提供组分鉴定及其丰度信息。RP-HPLC的分辨率远高于SE-HPLC。SE-HPLC推荐用于获取麸质级分（尤其是醇溶蛋白级分）的分子量分布信息，而RP-HPLC可用于鉴定和定量麸质级分中的单体和亚基。

2.2.3. 蛋白质组学

基于质谱的蛋白质组学工作流程主要包括以下步骤：样品制备、蛋白质提取、分离和消化、肽段分离和质谱分析以及数据分析。蛋白质组学在分析麸质级分的单体/亚基组成方面具有更高的灵敏度和分辨率，可提供更准确的定性和定量数据。然而，其应用仍受限于复杂的样品制备、高昂的仪器成本、困难的数据分析以及对蛋白质序列数据库的依赖。

2.3. 麸质分子的结构表征

2.3.1. 二级结构

麸质分子的二级结构元素主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。对于从面团中提取的麸质蛋白，常应用傅里叶变换红外光谱和傅里叶变换拉曼光谱来测量其二级结构。两种方法高度相似，但工作原理不同。FT-IR易受样品中水分含量的影响，而FT-Raman则具有抗水干扰的内在特性。FT-IR具有更高的灵敏度、更强的信号强度和更快的数据采集速度。因此，FT-IR更适用于干燥固体样品的高通量筛选，而FT-Raman则更适用于处理水合或含水系统。

2.3.2. 三级和四级结构

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  巯基和二硫键的含量：巯基的量通常使用Ellman试剂通过分光光度法在412nm处直接测定。为了测定二硫键的量，首先对样品进行还原，将二硫键完全转化为巯基，然后测定总巯基。二硫键的量计算为游离巯基和总巯基差值的一半。常用的还原方法有β-巯基乙醇法和三(2-羧乙基)膦法。β-ME法适用于大规模、低成本测量，而TCEP法则更适合精确测量。
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  二硫键的构象：二硫键的构象由其C-S-S-C桥的取向定义，相应地分为旋转异构体，即gauche-gauche-gauche、trans-gauche-gauche和trans-gauche-trans。其中，SS_g-g-g构象通常是稳定的，有助于维持蛋白质正确的三级结构。为了量化这三种异构体的相对丰度，通常采用FT-Raman光谱，其中500–550 cm^-1区域可提供有价值的信息。
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  芳香族氨基酸的微环境：通常通过探测酪氨酸和色氨酸残基的微环境来了解蛋白质的三级和四级结构。为此，广泛使用FT-Raman光谱和荧光光谱。荧光光谱主要通过测量色氨酸残基的内源荧光来探测蛋白质的三级和四级结构。荧光法适用于样品量少或需要高分析精度的情况，而FT-Raman法则更适用于在线无损监测或比较条件差异显著的样品。

3. 聚集体尺度表征麸质蛋白的方法

3.1. 聚集度分析

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  总体聚集度：蛋白质分子的聚集总是导致纤维状β-折叠结构的形成。其数量可指示蛋白质分子的总体聚集度。为此，常使用硫磺素T探针的前表面荧光法。该方法灵敏度高，可应用于原位检测，但无法区分不同类型聚集体的来源，且测试结果受pH和离子强度等环境因素影响较大。
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  共价与非共价聚集度：麸质聚集体的形成和稳定由共价和非共价作用力共同驱动。共价作用力指二硫键，非共价作用力包括疏水相互作用、静电相互作用和氢键。基于此，麸质蛋白的总体聚集可进一步解析为共价和非共价成分。非共价成分可通过测定麸质聚集体在SDS溶液中的溶解度来解析，而SDS不溶性蛋白质的量则代表共价成分。

3.2. 麸质聚集体分析

为了准确分析麸质聚集体的外观（大小和形状），需要一个包含可控提取、基于尺寸的分级和精确定量的工作流程。

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  可控提取：关键在于以最小的干扰获取麸质聚集体悬浮液，以保持其天然形貌。通常采用温和的中性缓冲液体系。为了探究不同作用力对不同尺寸麸质聚集体形成的贡献，可使用能够选择性破坏特定键的提取剂。
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  基于尺寸的分级：提取的麸质聚集体常经过尺寸排阻色谱或不对称流场流分级分离，根据其物理尺寸将其分离为连续的洗脱物。SEC在成本、操作简易性、分析速度和重现性方面表现更好，但AsFlFFF可成功分离尺寸范围更宽的颗粒。如果麸质聚集体的尺寸范围在SEC限度内，则优先推荐使用SEC；而AsFlFFF特别适用于形态多变或不稳定的聚集体，以及未知粒径范围或含有超大尺寸麸质聚集体的样品。
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  精确量化：为了表征麸质聚集体的不同尺寸组分，需记录来自SEC或AsFlFFF的连续洗脱物谱图。根据测试目的，通常选择性地使用一种或多种浓度敏感检测器，如紫外吸收、示差折光、多角度光散射和动态光散射。紫外和DRI用于测定级分组分的浓度、质量和相对分子量。DLS用于研究聚集体的尺寸尺度和尺寸分布的均匀性，可提供流体力学半径和多分散性指数。MALS的原理是同时测量样品在多个角度的散射光强度，可测定绝对分子量、旋转半径和颗粒相互作用强度（以第二维里系数表征）。此外，通过联合使用DLS和MALS，还可以表征麸质聚集体的形状。

3.3. 参与麸质聚集体的作用力分析

麸质聚集体由各种共价和非共价键维持。为了测定非共价键的水平，常采用不同的溶剂来选择性解离特定的非共价键。非共价键的解离导致蛋白质溶解度增加。因此，解离某种非共价键所引起的溶解度增量可代表其在麸质聚集体中的水平。实践中有串联和并联两种模式。串联模式只使用一个样品，不同溶剂依次加入；而并联模式则需要三个相同的样品，测量在溶剂-样品对中进行。

4. 网络尺度表征麸质蛋白的方法

麸质网络是制备好的面团中形成的麸质蛋白最复杂和最大的组装体，是上述麸质聚集体之间共价和非共价相互作用的结果。对麸质网络的微观结构表征极其重要，其独特的特征赋予面团独特的粘弹性。为此，采用了各种显微成像技术，如共聚焦激光扫描显微镜、共聚焦拉曼显微镜、扫描电子显微镜和双光子激发显微镜。这些技术在检测能力上各不相同，例如操作模式、结果准确性和检测维度。

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  二维分析：CLSM、SEM和CRM可以探测麸质网络的二维结构图像。CLSM是最准确的原位可视化麸质微观结构的方法之一，属于原位定量方法。SEM是表征颗粒表面超微结构或物体横截面的非常有用的工具，分辨率高达1 nm，目前仅能定性描述麸质网络。CRM结合了拉曼光谱的化学敏感性和共聚焦显微镜的空间分辨率优势，属于原位方法，但通常对麸质网络进行定性描述。在表征麸质网络的精细结构时，CLSM由于其快速、高对比度、标准化的成像，是主流选择。
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  三维分析：与二维图像相比，三维图像的捕获需要更复杂、成本更高的技术。如今，通过将光学透明试剂与双光子显微镜或CLSM相结合，可以成功记录毫米级深度和亚微米分辨率的三维麸质网络结构。相比之下，本方法可以进行麸质网络的定量分析，但其操作更为复杂和耗时。该方法在从任何方向查看所需区域和平面图像方面优于二维CLSM，从而能更好地理解麸质结构。尽管三维表征技术能够更真实、全面地还原麸质网络的空间结构和连通性，但二维分析方法在麸质结构研究中仍然被广泛使用。核心原因在于二维方法具有样品制备简单、检测快速、成本低、定量算法成熟以及适合高通量样品筛选等固有优势。

5. 挑战与展望

尽管上述各种现代分析技术的结合在阐明面团中麸质蛋白的多尺度结构方面取得了巨大进展，但由于麸质蛋白的难以置信的复杂性，特别是麸质网络的结构，该领域仍存在许多挑战。现有技术存在一些缺陷，如分级分离中的交叉污染、高级结构表征的间接性和局部性、分离技术对聚集体天然结构的破坏、成像技术的视场限制、不同文献间测试程序和条件的差异、多尺度结构信息缺乏整合解释、以及动态变化规律不明确等，这些问题都亟待解决。

6. 结论

麸质蛋白在分子、聚集体和网络尺度上的多尺度结构是面团特性和面粉基食品质量的主要决定因素，因此值得精细表征。近年来，在阐明不同尺度下麸质蛋白结构的技术方面取得了巨大进展。在综述这些方法时，对用于相同结构参数的同类技术进行了比较，旨在为技术选择提供场景指导。此外，为每种技术推荐了一个典型示例，并提供了原理、仪器、试剂、操作图和结果展示，以便于这些技术的应用。最后，讨论了该主题的挑战和前景，为改进这些技术或为此任务开发新技术提供了重点方向。