《Biomolecules》：X-Linked EGFP Reporter as a Tool to Examine X-Chromosome Inactivation in Mouse Embryos and Embryonic Fibroblasts
Martin Urbán,
András Ecker,
Roland Imre Tóth,
Bence Lázár,
Szilárd Bodó and
Elen Gócza
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本研究旨在建立利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠品系来研究X染色体失活的模型。D4/XGFP-Tg（XGFP）品系的X染色体上携带GFP转基因；因此，由于随机的X染色体失活，XGFP雄性与CD-1雌性杂交产生的雌性后代呈现嵌合体GFP表达。相比之下，B
本研究旨在建立利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠品系来研究X染色体失活的模型。D4/XGFP-Tg（XGFP）品系的X染色体上携带GFP转基因；因此，由于随机的X染色体失活，XGFP雄性与CD-1雌性杂交产生的雌性后代呈现嵌合体GFP表达。相比之下，B5/EGFP-Tg（EGFP）品系在常染色体上整合了相同的报告基因构建体，导致后代中GFP表达均匀。对CD-1×XGFP附着囊胚的分析显示，在胚胎第6.5天，巨大滋养层细胞和原始生殖细胞（PGCs）中有强烈的GFP表达，证明了父源X染色体的重新激活。在14.5天龄的CD-1×XGFP雌性胚胎和CD-1×EGFP胚胎中，大脑、心脏、生殖腺、体节和四肢中检测到强烈的CAG启动子驱动的GFP信号。与随机X染色体失活一致，来源于CD-1×XGFP雌性胚胎的胚胎成纤维细胞中，仅56%表现出GFP表达。这些发现证实，CD-1×XGFP小鼠是研究早期胚胎发育和原始生殖细胞（PGC）特化过程中X染色体失活的有价值的体内模型。此外，CD-1×XGFP胚胎成纤维细胞是研究调控X染色体激活与失活的分子机制的有价值的体外模型。
本研究通过建立并利用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的转基因小鼠模型，深入探究了小鼠早期胚胎发育过程中的X染色体失活（XCI）现象。X染色体失活是雌性哺乳动物中一种关键的剂量补偿机制，通过随机或印记方式沉默一条X染色体，以确保两性间X连锁基因的表达剂量平衡。然而，关于XCI在特定细胞谱系（如滋养外胚层和原始生殖细胞）中的动态变化，以及父源X染色体在早期发育事件中的再激活规律，仍需在活体模型中进行可视化与量化分析。此前的研究模型（如基于lacZ报告基因的模型）无法在活体组织或细胞培养中进行实时观测。因此，开发一种能够直观、动态监测XCI的体内外模型，对于理解发育表观遗传调控和细胞命运决定至关重要。本研究的核心是验证一种新型的X连锁GFP报告小鼠（CD-1 × XGFP）在研究XCI中的实用性，并与常染色体整合的对照品系（CD-1 × EGFP）进行比较，从而为相关研究提供有力的工具。相关研究成果发表在《Biomolecules》期刊上。
为开展此项研究，研究人员采用了几个关键技术方法。研究使用了两种转基因小鼠品系：D4/XGFP-Tg（XGFP，报告基因整合于X染色体）和B5/EGFP-Tg（EGFP，报告基因整合于常染色体），并将其与野生型CD-1品系进行杂交以获得实验胚胎。样本队列包括从上述杂交组合中获取的胚胎（E3.5、E4.5、E6.5、E14.5天）以及由其建立的胚胎成纤维细胞（MEF）细胞系。核心技术手段包括：1) 胚胎显微操作与体外培养，用于观察植入前及植入后胚胎的GFP表达模式；2) 免疫荧光染色，使用针对P63的抗体对附着囊胚进行标记，以鉴定特定细胞类型（如PGCs）；3) 荧光显微镜成像与分析，利用立体显微镜和共聚焦显微镜在不同发育阶段对GFP表达进行定性和定量观测；4) 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的分离、培养与流式细胞术分析，用于量化体外细胞模型中GFP阳性细胞的比例。
3.1. 植入前胚胎中EGFP表达模式的检测
研究人员在E3.5、E4.5和E6.5天对胚胎的GFP表达进行了分析。在E3.5天，所有EGFP×EGFP胚胎均显示强烈而均匀的荧光，而CD-1×XGFP胚胎中仅约一半（6/13）可检测到GFP表达。在E4.5天，CD-1×XGFP胚胎在内细胞团（ICM）中呈现微弱且嵌合式的GFP表达。至E6.5天，在CD-1×XGFP胚胎的ICM内观察到嵌合式GFP表达，且胚胎间荧光强度存在显著差异，这归因于X连锁转基因的表达强度低于常染色体整合的报告基因，以及雌性胚胎中随机XCI导致的嵌合表达模式。
3.2. 附着囊胚的研究
将胚胎附着于饲养层细胞上继续培养并进行免疫染色分析。在雌性CD-1×XGFP胚胎中，观察到具有强GFP表达的巨滋养层细胞，这与父源X染色体再激活的报告一致。此外，在附着ICM外围的一小群圆形细胞中发现了GFP与P63的共表达，这些细胞被鉴定为原始生殖细胞（PGCs）。雌性胚胎的上胚层细胞中也检测到GFP表达。而在雄性CD-1×XGFP胚胎中，由于缺乏X连锁转基因，未检测到GFP表达，但基于形态和P63阳性仍可识别出PGCs。
3.3. 14.5天龄胚胎的研究
比较CD-1×XGFP与CD-1×EGFP胚胎发现，在相同成像条件下，前者GFP表达弱且呈嵌合模式，后者则强而均匀，反映了报告基因整合位点（X连锁 vs. 常染色体）的影响。在14.5天龄的CD-1×XGFP胚胎中，在胎盘（胎儿层）、大脑、心脏、生殖腺内的生殖细胞、体节、四肢（特别是指间间充质）以及鼻区（对应毛囊基板）均检测到强烈的GFP信号，但这些表达呈现明显的嵌合模式，尤其是在心肌中，这与随机XCI一致。
3.4. 小鼠胚胎成纤维细胞系的建立
研究人员从E14.5胚胎建立了MEF细胞系，并利用荧光细胞计数器定量分析GFP阳性细胞比例。在雄性来源的细胞系中，EGFP品系（EGFP–EGFP-1♂和CD-1 × EGFP-IIa♂）分别有91%和86%的细胞表达GFP，而CD-1 × XGFP-9♂细胞系未检测到GFP阳性细胞。在雌性来源的细胞系中，EGFP品系（EGFP–EGFP-2♀和CD-1 × EGFP-Ia♀）分别有94%和95%的细胞表达GFP，而CD-1 × XGFP-7♀细胞系中仅有约56%的细胞表达GFP，这与随机XCI导致预期约50%细胞失活X连锁转基因的结果相符。
在讨论部分，研究人员将观察结果置于现有知识的背景下进行阐释。在早期小鼠胚胎发生中，父源X染色体的印记失活发生在2-4细胞阶段，并在滋养外胚层谱系中维持，但本研究在巨滋养层细胞中观察到的GFP表达模式支持了该细胞中存在父源X染色体再激活的报道。在附着的ICM中观察到的嵌合GFP表达，表明ICM来源的细胞已启动向上胚样状态的转变，其特征是印记XCI的丢失。P63阳性的PGCs表现出比周围ICM更强的GFP表达，支持了它们独特的发育特性。在胎盘发育后期，滋养层祖细胞经历额外的父源X染色体再激活周期，本研究结果与X连锁基因表达的动态调控一致。不同组织间GFP表达水平的差异可能由多种因素导致，例如高血红蛋白含量组织的荧光猝灭效应，或肝脏等组织中由DNA甲基化和组蛋白修饰引起的组织特异性启动子活性抑制及自身荧光干扰。大脑、心脏和生殖腺中检测到的高表达水平则由转基因构建体中的CAG启动子驱动。XCI在早期发育中建立并通常在后续细胞分裂中维持，原始生殖细胞（PGCs）中的表观遗传重编程是一个例外，会导致先前沉默的X染色体再激活。本研究建立的成纤维细胞培养系统可能适用于研究体外分化模型中的组织特异性启动子活性。EGFP品系（常染色体整合）与XGFP品系（X染色体整合，受随机XCI影响）在表达水平和模式上的差异，证实了报告基因基因组定位的影响。同时，研究人员也指出了本研究的局限性：GFP表达仅是X染色体活性的间接读数，不能完全捕捉XCI调控的分子复杂性（如Xist1RNA涂层、组蛋白修饰和DNA甲基化动态）；体外培养条件可能改变细胞的表观遗传状态，不能完全反映体内情况。
- 1.
Xist: X-inactive specific transcript，X染色体失活特异性转录本。
最后，论文的研究结论部分总结如下：总之，本研究发现GFP表达在不同器官和组织间存在差异，这为了解组织特异性基因活性、移植行为和无性系动态提供了宝贵信息。共聚焦激光扫描显微镜是一种适用于在多种组织中以单细胞分辨率绘制EGFP表达图谱的合适方法。
