基于Captiva EMR-Lipid固相萃取测定人血浆中19种芳香胺抗氧化剂和两种对苯二胺醌的分析方法

《Toxics》：Solid-Phase Extraction Based on Captiva EMR-Lipid for Determination of 19 Aromatic Amine Antioxidants and Two p-Phenylenediamine Quinones in Human Plasma Bowen Liang, Qing Deng, Zibin Pan, Bibai Du and Lixi Zeng

　　

摘要 研究人员开发并验证了一种基于Captiva EMR-Lipid固相萃取和高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）的稳健分析方法，用于同时测定人血浆中的19种芳香胺抗氧化剂(AAs)和两种对苯二胺衍生醌(PPD-Qs)。相比传统的液-液萃取，优化后的方案有效去除了复杂血液基质中的磷脂干扰，显著减轻了离子抑制效应，并提高了疏水性AAs的回收率。方法验证表明其具有良好的准确度（加标回收率：73.0-96.8%）、精密度（相对标准偏差RSD < 11%）和灵敏度，方法检出限在0.81至21 pg/mL之间。该方法成功应用于20名成人血浆样本的分析，检测出11种AAs，总浓度范围为240-710 pg/mL。其中，二苯胺衍生物，特别是双(4-叔丁基苯基)胺(DBDPA)和二苯胺(DPA)是主要检出的化合物，占总AA负荷的69%以上。未检测到PPDs或PPD-Qs，这可能是由于它们的生物转化和尿液排泄，以及样本量有限所致。本研究为评估人类对多种AAs的综合暴露提供了一种全面的生物监测工具，并为进一步研究其健康影响奠定了基础。

一、 研究背景、问题与研究目的

芳香胺抗氧化剂(AAs)是一类广泛应用于工业和消费品领域的化学添加剂，主要用于防止聚合物材料（如橡胶、塑料）和润滑油因热、氧和光引起的氧化降解。AAs根据其化学结构主要分为二苯胺(DPAs)、对苯二胺(PPDs)和萘胺(NPAs)。随着在橡胶、塑料等领域需求的增长，AAs的年产量和消费量持续上升。然而，大量证据表明这些化学品具有不可忽视的潜在健康风险。部分AAs及其转化产物已被证实具有水生致死毒性、发育毒性、哺乳动物器官毒性和神经毒性等。例如，6PPD的氧化产物6PPD-醌(6PPD-Q)被证实是导致银鲑急性死亡的关键毒物。因此，随着AAs使用量的增加，其对生态系统和人类健康的潜在威胁日益受到环境科学与公共卫生研究的关注。

AAs可通过工业生产、产品磨损、废物处置等多种途径进入环境，并在大气颗粒物、地表水、沉积物、土壤及室内外灰尘等多种环境介质中检出。更值得注意的是，这些化合物已通过各种途径（吸入、饮食、皮肤接触）进入人体，并在尿液、血液、母乳甚至脑脊液等人体样本中检出，构成了人体内部暴露。血液作为体内化学物质运输、分布和代谢的关键介质，能更全面地反映个体近期及长期的暴露水平，是健康风险评估的重要生物标志物。然而，当前针对人体血液中AAs的检测研究主要集中在少数高关注的PPD类化合物（如6PPD及其转化产物6PPD-Q）。现有分析方法通常采用较为简化的血液样本前处理程序，如蛋白沉淀后直接进样，或仅采用液-液萃取(LLE)等基本步骤，缺乏针对复杂血液基质的深度净化。人血基质高度复杂，含有大量的内源性物质，如蛋白质、磷脂、胆固醇和脂肪酸。这些基质成分，特别是磷脂，在电喷雾电离-质谱分析中会引起显著的离子抑制或增强效应，严重干扰目标化合物的准确定性和定量，并可能导致仪器污染和灵敏度下降。

因此，开发一种能够高效去除磷脂等干扰物质，并能同时准确定量多种AAs及其重要转化产物的血液样本前处理方法，对于全面评估人体暴露水平及相关健康风险至关重要。固相萃取(SPE)具有溶剂消耗低、净化效率高、操作简单等优势，已成为复杂生物基质中痕量有机化合物分析的主流前处理技术。本研究旨在开发并优化一种结合了新型Captiva EMR-Lipid（增强基质去除-脂质）固相萃取与高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)的分析方法，首次实现对19种AAs（涵盖DPAs、PPDs和NPAs）和2种关键的PPD衍生醌(PPD-Qs)的同时提取、净化和测定，以弥补现有方法的不足，显著提高分析准确度和精密度，为系统评估人类对多种AAs的综合暴露提供稳健的分析工具。本论文发表于《Toxics》期刊。

二、 主要关键技术方法

研究人员从南方医科大学珠江医院随机招募了20名志愿者，采集了血浆样本。研究建立的核心方法是结合了Captiva EMR-Lipid固相萃取的样品前处理与高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS) 仪器分析。前处理优化方面，研究人员比较了传统的液-液萃取(LLE)方案与引入Captiva EMR-Lipid SPE净化步骤的改进方案，发现后者能有效去除基质中的脂质，显著提高目标物（特别是疏水性AAs）的回收率。仪器分析使用ExionLC AC液相色谱系统与Triple Quad 5500质谱仪联用，色谱柱为XBridge BEH C₈柱，在正电喷雾电离(ESI)和多反应监测(MRM)模式下进行分析，并采用六通阀控制流出物以减少对质谱仪的污染。方法在准确性、精密度、线性、检出限(LOD)和定量限(LOQ)等方面进行了全面验证。

三、 研究结果

3.1. 前处理方法的优化

研究人员评估了仅使用LLE方案时19种AAs和2种PPD-Qs的加标回收率。结果显示，在仅LLE处理下，所有目标分析物的回收率范围为43.5%至94.4%，其中BDPA、DNODPA/DTODPA、DM-AD和PANA/PBNA的回收率低于60%。分析认为，低回收率可能源于血液基质中的脂质在质谱分析中引起的离子抑制。相比之下，亲水性较强的PPDs和PPD-Qs回收率相对较高（74.0-87.7%），因为它们不易在色谱分离中与脂质共洗脱。为解决此问题，研究人员引入了Captiva EMR-Lipid SPE净化步骤。改进后，原先回收率低的分析物回收率显著提高，所有分析物的总体回收率范围改善至73.5-96.1%。结果表明，Captiva EMR-Lipid SPE过程中的脂质去除有效减轻了血液基质引起的离子抑制，且未引入明显的分析物损失。

3.2. 方法验证

对所建立的方法进行了全面的方法学验证。在5000 pg/mL和2500 pg/mL两个加标水平下，AAs和PPDs的回收率在73.0%至96.8%之间，回收率的相对标准偏差(RSD)在2.6%至11%之间，表明方法具有可接受的准确度和精密度。所有分析物的基质效应在74.4%至93.7%之间，表明基质干扰得到了有效缓解。所有校准曲线在0.01-100 ng/mL浓度范围内均表现出良好的线性（R²≥ 0.996）。方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)范围分别为0.813至20.9 pg/mL和2.71至69.7 pg/mL。与已报道方法相比，本研究建立的方法成功地将DPAs和NPAs纳入分析范围，并获得了满意的回收率和可比拟的定量限。

3.3. 实际血浆样本检测

将该方法应用于20名普通成人的血浆样本分析。结果在样本中检测出11种AAs，其总浓度范围为240至710 pg/mL，中位浓度为400 pg/mL。DPA、DBDPA、BDPA、PANA/PBNA、diAMS和DNODPA/DTODPA在样本中频繁检出，检出率(DF) > 60%；其中，DPA和DBDPA在所有样本中均被检出。DBDPA是血浆中的主要AA，中位浓度为180 pg/mL，平均贡献率为47.2%，其次是DPA（21.9%）、PANA/PBNA（11.8%）和DNODPA/DTODPA（8.6%）。未检测到任何PPDs或PPD-Qs，这与先前报道的血液中PPDs和PPD-Qs低检出率一致，可归因于它们在体内的生物转化和通过尿液排泄。虽然本研究受限于小样本量，但结果表明普通成年人群很可能广泛暴露于多种AAs，其中以往关注相对较少的DPAs构成了不可忽视的内部负担。

四、 讨论与结论

讨论： 本研究观察到，当将常用于分析血液中PPDs和PPD-Qs的LLE方法应用于包含DPAs、NPAs和PPDs在内的多种AAs时，由于缺乏净化步骤，基质干扰（特别是几种疏水性AAs）在质谱分析中导致了显著的离子抑制。为解决此问题，研究建立并验证了一种基于Captiva EMR-Lipid SPE净化结合HPLC-MS/MS的稳健、灵敏的分析方法，用于同时测定人血浆中的19种AAs和2种PPD-Qs。该方法成功应用于普通人群的血浆样本，检出11种AAs。本工作的意义在于，与以往主要针对PPD相关化合物的方法相比，本研究建立的方法能够分析更广谱的AAs，可对人类综合暴露进行更全面的评估。

结论 (翻译自原文“4. Conclusions”)：

在本研究中，我们观察到，当将常用于分析血液中对苯二胺(PPDs)及其醌(PPD-Qs)的液-液萃取(LLE)方法应用于包含二苯胺(DPAs)、萘胺(NPAs)和PPDs在内的芳香胺抗氧化剂(AAs)时，由于缺乏净化步骤，基质干扰（特别是针对几种疏水性AAs）在质谱分析中导致了显著的离子抑制。为解决此问题，开发并验证了一种基于Captiva EMR-Lipid固相萃取(SPE)净化结合高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)的稳健且灵敏的分析方法，用于同时测定人血浆中的19种AAs和2种PPD-Qs。该方法成功应用于普通成年人群的血浆样本，从而检测出11种AAs。这项工作为监测人血中多种AAs和PPD-Qs提供了一种经过验证的工具，为普通人群AAs内部暴露情况提供了初步见解，并为未来旨在评估相关健康风险和阐明人体暴露途径的大规模研究奠定了方法论基础。